【논문】 Preparation and Characterization of Novel Bone Scaffolds Based on Electrospun Polycaprolactone Fibers Filled with Nanoparticles

Patcharaporn Wutticharoenmongkol, Neeracha Sanchavanakit, Prasit Pavasant, Pitt Supaphol

Macromol. Biosci. 2006, 6, 70-77^[각주:1]

 

요약: CaCO₃ 또는 HA 나노입자를 첨가한 PCL 용액을 이용한 새로운 뼈-스케폴딩 방법이 성공했다. 첨가하는 나노입자의 양이 증가할수록 방사된 섬유의 직경이 커지는 것으로 관찰됐다. 직경 증가로 인해 인장강도의 증가도 또한 관찰됐다. PCL의 농도와 인가 전압의 증가 또한 섬유의 직경을 커지게 하는 데 기여하였다. 사람의 조골세포(SaOS2)와 쥐의 섬유아세포(L929)에 PCL, PCL/CaCO₃, PCL/HA을 넣었을 때 세포독성 평가도 실시하였으며, 그 결과 세포독성이 관찰되지 않아 뼈-스케폴딩에 적합하다는 결론을 얻었다.

 

소개: 전기방사법은 서브마이크로미터 수준에서 나노미터 수준에 이르는 나노섬유를 생산하는 데 쓰이는 흥미로운 방법이다. 전기방사법은 연속적인 필라멘트를 고전압의 방적돌기에서 나와 접지된 콜렉터에 쌓는 방법이다. 이 방법에서 세 가지 가장 중요한 요소를 꼽자면, 고전압 전원장치, 노즐이 달린 용액저장소, 도체로 된 콜렉터 장치이다. 섬유를 방출하는 쪽의 전극은 도체로 된 노즐에 연결시킨다.  전기장을 특정 임계값 이상으로 증가시키면 노즐 끝에 달린 물방울이 구형에서 원추형(Taylor 원뿔이라 불림)으로 바뀌게 된다. 그 임계값을 벗어나게 되면 대전된 고분자 제트가 전기장을 따라 원뿔의 꼭짓점에서 콜렉터로 이동한다. 그 섬유가 아주 얇은 나노섬유가 되는 것은 쿨롱 척력에 의한 것이다. 대전된 고분자 제트는 공기중으로 나오는 즉시 증발해서 고체화된다.

  방사된 섬유의 높은 표면적 대비 체적비와 서브마이크로미터 스케일 섬유의 높은 공극률에 의해 제안된 방법은 나노섬유가 요구되는 생명과학 분야(예: 약물 전달, 상처 치료, 조직공학적 스캐폴딩)에 적합할 것이다. 조직공학에서 직면된 문제는 세포외기질(ECM)을 모사하는 스캐폴드를 만들어 내는 것이다. 전기방사된 섬유는 높은 공극률을 가진 3차원 구조를 가져서 ECM 상의 섬유질 콜라젠의 구조와 닮아 그러한 스캐폴드의 조건을 만족한다. 생명과학에서 가장 자주 쓰이는 폴리머는 생체적합성, 생분해성을 가지는 PLA, PGA, 그리고 PCL이다. 이 중 PCL은 생분해 속도가 느려서 뼈-스캐폴딩을 하는 데 있어서 적절한 후보가 된다. PCL의 전기방사법은 여러 용액에서 성공적이었다고 보고되고 있다. PCL 섬유 상에서의 연골세포와 조골세포의 배양 또한 보고되고 있다. 게다가, 많은 연구자들은 CaCO₃와 같은 칼슘 탄산염 또는 HA와 가튼 칼슘 인산염이 조골세포의 증식과 분화를 촉진한다고 보고하고 있다.

  본 논문에서는 CaCO₃ 또는 HA 나노입자를 첨가한 PCL 섬유에서의 새로운 뼈-스캐폴딩을 소개하고 있다. HA 나노입자를 합성하는 데 사용되는 여러 방법 중에 가수분해가 단순한 방법이었기에, 이번 논문에서는 그 방법을 채택했다. 형태 관찰, 역학강도 조사, 세포독성 평가도 실시하였다.

 

실험 방법

재료, 합성, HA 제조

PCL(Aldrich, USA)의 평균 분자량은 80,000 g/mol이다. Dichloromethane(Carlo Erba, Italy)와 DMF(Lab-Scan(Asia), Thailand)는 PCL의 용매로써 사용됐다. CaCO₃ 나노입자(평균 일차 입자 크기 = 40 nm)는 NanoMaterials Technology (Singapore)에서 제공받았다. HA 나노입자는 DCPD(CaHPO₄·2H₂O; Fluka Chemika, Switzerland)를 참고문헌에 있는 가수분해 반응을 이용하여 만들었다. 가수분해를 한 뒤에 HA 파우더는 800 ℃에서 4시간동안 가해졌으며, 이 때의 가열속도는 1 ℃/분이었다. 이렇게 얻어진 HA 파우더는 Rigaku Rint2000의 WAXD(wide-angle X-ray diffractometer)에서 흑백의 CuK_α의 흡광도(λ = 1.54 Å)의해 확인되었다. CaCO₃와 HA 파우더의 형태와 크기는 각각 JEOL JSM 5410LV의 SEM과 MALVERN MastersizerX의 입자 크기 분석기로 확인하였다.

 

전기방사 준비

특정량의 PCL을 dichloromethane와 DMF를 50:50 (v/v)로 섞은 용매에 녹였다. 첨가물의 효과를 알아보기 위해, 0.5 또는 1.0% (w/v)의 CaCO₃ 또는 HA 파우더를 12% (w/v) PCL 용액에 첨가했다. PCL의 농도에 따른 효과를 알아보기 위해 PCL과 HA의 무게 비를 12:1로 유지한 태로 8, 10, 12% (w/v) PCL 용액을 준비했다. 전기방사 전에 각 용액에 대한 점도(Brookfield DV-Ⅲ의 컴퓨터 기반 점도계), 전기전도도(Orion 160의 전도계), 표면장력(KRÜSS DSA 10-MK2의 물방울 분석기)을 분석하였다. 모든 분석은 실온(25 ± 1℃)에서 이루어졌다.

  전기방사에서 방사할 용액은 50 ml 유리 주사기 내에 포함돼 있었고, 그 주사기의 열린 끝은 노즐로 사용될 20짜리 스테인리스 스틸 바늘 (OD = 0.91 mm)과 연결했다. 드럼 회전체(너비 = 14 cm, OD = 15 cm, 회전 속도 = 50 rpm)를 콜렉터로 사용하였다. 드럼 회전체의 표면과 바늘의 끝이 10 cm가 되도록 거리를 설정하였다. Gamma High-Voltage Research D-ES30PN/M692의 전원공급장치는 높은 진류전압을 생성한다. 이를 이용하여 섬유를 방사하는 전극의 극성은 +극을 유지한 태, 10, 15, 21 kV로 전압을 설정했으나 첨가물의 효과 및 농도의 효과를 보는 실험에서는 21 kV로 고정하였다. 폴리머 용액을 1 ml/h로 공급하기 위해 Kd Scientific의 주사기 펌프를 이용하였다. 방사된 섬유를 40 ℃ 진공의 오버나이트로 두어 최대한 용매가 증발되도록 하였다. 방사된 섬유의 형태는 SEM으로 확인하였다. SEM으로 확인하기 전 각 샘플은 JEOL JFC-1100E의 금속코팅기로 얇은 금박을 씌웠다. 방사된 섬유의 직경은 SemAphore 4.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 위와 같은 실험에서, 방사 시간은 대략 10분으로 고정하였다.

 

방사된 섬유의 물리적 특성 측정

전기방사된 섬유들은 또한 물리적 특성(예: 평균 섬유 직경, 평균 공극 크기, 공극률)을 분석됐다. 이러한 섬유성 스캐폴드는 10 cm 간격의 21 kV를 유지한 채 10시간동안 방사해서 마련됐다. 결과적으로 그 두께는 대략 130 ㎛이었다. 

  탄성계수와 항복 응력은 Lloyd LRX의 보편적 테스트 장치 (측정기 길이 = 50 mm, 크로스헤드 속도 = 10 mm/분)로 측정하였다. 방사된 섬유의 매트들을 10 mm × 70 mm로 잘랐다. 섬유 매트의 평균 직경과 평균 공극 크기는 SEM으로 분석하였다. 평균 공극 사이즈는 수평 직경과 수직 직경의 평균으로 취하였다. 마지막으로 방사된 섬유 매트의 공극률(ε)은 PCL의 밀도(ρ_PCL)(즉, 1.145 g/㎤)와 스케폴드의 밀도(ρ_sc)에 대한 다음 수식을 이용하여 구하였다:

 

  

섬유성 스캐폴드의 밀도는 Sartorius YDK01의 밀도 측정 장치에 의해 측정됐다.

 

세포독성 평가

두 종류의 세포가 사용되었다: 1) 사람의 조골세포(SaOS2), 2) 쥐의 섬유아세포(L929). 두 개의 세포 유형은 DMEM(Sigma-Aldrich, USA), 10% FBS(fetal bovine serum)(BIOCHROM AG, Germany), 1% L-glutamine(Invitrogen Corp., USA), 1% 항생제(penicillin G sodium, streptomycin sulfate, amphoperin B 포함)(Invitrogen Corp., USA)의 배지에 배양하였다. 세포의 배지는 1주일에 1번 교체하였고, 배지는 37 ℃, 5% CO₂, 다습한 환경에서 보관하였다.

  우선 24-well 플레이트 각각에 3 종류(12% (w/v) PCL, 12% (w/v) PCL + 1.0% (w/v) CaCO₃, 12% (w/v) PCL + 1.0% (w/v) HA)의 섬유성 스캐폴드(직경 15 mm, 두께 130 ㎛)를 붙이고 SaOS2와 L929 세포들을 그 위에 seeding한다. 그 뒤 24-well 플레이트에 배양 배지(즉, DMEM + FBS + L-glutamine + 항생제)로 16시간 동안 기다려서 세포가 플레이트에 잘  붙도록 기다린다. 그 뒤 SFM(serum-free medium)를 넣고 24 시간 동안 굶긴다. 그러고 나서 MTT(3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenul-tetrazolium bromide) assay를 해서 살아 있는 세포의 양을 정량한다.

  MTT assay는 살아 있는 세포 내 미토콘드리아가 가지고 있는 탈수소효소로 인해 노란색 테트라졸륨(tetrazolium) 염이 보라색 포르마잔(formazan) 결정을 형성하는 환원반응을 이용하는 것이다. 보라색 포르마잔 결정의 양은 살아 있는 세포의 수에 비례한다. 우선, 각 well에 있는 배지는 0.5 g/㎖ MTT 용액 250 ㎕로 대체된다. 그 뒤 그 플레이트는 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 그 뒤 각 well에 125 ㎕의 글리신 완충액(pH = 10)을 포함하고 있는 900 ㎕의 DMSO(dimethylsulfoxide)를 첨가해서 포르마잔을 용해시킨다. 마지막으로 10분동안 회전(rotary agitation)시킨 뒤, Genesis10 UV/Visible 분광기(Thermo Electron Corp., USA)를 이용하여 570 ㎚에서에서의 흡광도를 잰다.

 

결과와 논의

HA의 합성과 나노입자의 특징

DCPD(CaHPO₄·2H₂O)는 HA를 합성하는 데 필요한 전구체 중의 하나이다. DCPD는 다음과 같은 반응으로 가수분해된다.

 

 

  DCPD의 용해도가 낮지만, 이 가수분해 반응은 높은 pH(>10), 60 ℃에서 빠른 고체-고체 전환 반응이다. 그러므로 DCPD의 용해도는 덜 중요하다. 800 ℃에서 어닐링한 뒤에 HA 파우더의 WAXD 패턴은 Figure 2와 같다. HA의 평균 수득량은 대량 90%로 나타났다. 26, 32, 33, 53°에서의 산란각에서의 피크는 각각 HA의 산란면 (002), (300), (211), (004)과 일치했다. HA는 육각형 단위 셀의 형태로 결정화한다고 보고됐으며, 이때 P6₃/m 공간군에서 a = b = 9.418 Å, c = 6.884 Å이었다(JCPDS card no. 9-432). 다른 지점에서의 피크는 다른 인산염에 의한 오염에 의한 것으로 여겨진다. 예를 들면, 40, 46°에서의 산란각은 CaNaPO₄와 일치했다.

  HA 파우더의 형태를 Figure 3과 같이 SEM으로 관찰하였다. 일차 입자와 이차 입자 모두 분명히 관찰됐다. SEM 이미지로부터 입자들의 크기를 측정할 수 있었으며, 그 값은 234±68 ㎚이었다. 반면에, 입자-크기 분석장치의 결과에 따르면 이봉분포를 보였으며, 더 작은 평균값은 500 ㎚였다(Figure 4). 동일한 분석장치로 CaCO₃를 분석한 결과 더 넓은 분포가 관찰됐다. 이 경우 더 작은 평균값은 대량 800 ㎚였다. 이 장치는 물을 매개로 하고 나노입자들은 소수성이었으므로 소수성 상호작용에 의해 기존보다 더 크게 뭉쳤을 거라고 여겨진다. 

 

첨가물의 효과

PCL의 전기방사는 다양한 용매에서 성공적이다. 이 박사와 그의 동료들은 PCL의 전기방사능은 dichlroromethane에 DMF를 공동용매로 첨가하면 대단히 증가한다는 것을 발견했다. 본 논문은 dichloromethane와 DMF의 50:50 (w/w) 혼합물을 PCL, PCL/CaCO₃, PCL/HA를 만드는데 사용하였다. 

  모든 실험군에 대한 점성, 전기전도도, 그리고 표면장력은 Table 1에 나와 있다. 분명하게, 첨가물이 많을수록 방사되는 용액의 점도는 증가했고, 전기전도도는 감소했다. 표면장력은 크게 변하지 않았다. 아인슈타인은 오래 전에 비상호적인 고체 입자가 묽은 서스펜션의 표면 점성을 증가시킨다고 지적한 바 있었다. 또한 전기전도도의 경우 비전도적인 CaCO₃와 HA가 많을수록 전기전도도는 더 작을 터였다.

  Figure 5는 CaCO₃, HA에 따른 여러 PCL 용액에 대한 SEM 사진이 나와 있다. 기본적인 PCL의 농도는 12% (w/v)였고, 전기방사는 10 cm 거리로 21 ㎸, 10분동안 실시됐다. 분명하게 구슬모양으로 응어리진 게 아니라 매끈한 섬유를 이루고 있음을 알 수 있다. 조금 작은 농도(즉, 10% (w/v))에서 응어리지는 섬유(결과에는 나와 있지 않음)가 관찰되기도 하는데, 이는 점탄성 힘이 쿨롱 힘에 비해 더 작았기 때문으로 여겨진다. 두 나노입자로 인해 섬유가 거친 섬유가 된다. 나노입자가 첨가되지 않은 PCL 섬유의 평균직경은 0.95 ㎛였고 나노입자가 첨가된 PCL 섬유의 평균직경은 1.02와 1.26 ㎛ 사이의 값을 가졌다(Table 1). 명백하게, 첨가물을 많이 넣을수록 합성된 섬유의 직경이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 분명 나노입자로 인해 나노섬유의 점성이 증가한 결과로 여겨진다.

 

PCL의 농도에 따른 효과

PCL 용액의 농도에 따른 형태와 크기상의 효과는 PCL을 8, 10, 12% (w/v)로 농도를 다양하게 함으로써 수행되었다. 이때 PCL과 HA의 무게 비는 12 : 1로 유지하였다. Table 1에 따르면 PCL의 농도가 증가할수록 방사된 섬유의 점도가 증가하고 전기전도도와 표면장력이 감소함을 알 수 있다. 점도가 PCL 농도에 따라 크게 증가하는 까닭은 PCL 분자의 뒤얽힘 때문일 것이다. 이들 실험의 조건은 모두 21 kV, 10 cm 거리, 10분 방사로 고정하였다. Figure 6dms 방사된 매트를 보여주고 있다. 분명히 PCL 농도 증가에 따라 방사된 섬유의 직경이 증가하고 있고, 이는 점도의 증가에서 예측된 결과였다. 이렇듯 농도의 증가는 방사되는 제트에서 쿨롱 힘으로 인한 분자 간 반발력에 저항하는 데 관여하고 있다. 특히, PCL의 농도가 8% (w/v)이었을 때의 방사된 섬유의 직경이 0.28 ㎛였고, 12%(w/v)이었을 때의 방사된 섬유의 직경이 1.26 ㎛로 굉장한 차이가 남을 주목해 본다.

 

인가전압의 효과

인가전압이 방사되는 섬유의 형태 및 크기에서으 효과 또한 확인해 보았다. 12%(w/v) PCL과 1.0%(w/v) HA가 10, 15, 21 kV로 서로 다른 전압에서 10 cm 거리, 10분 방사 조건은 유지한 채 수행되었다. 동그랗게 응어리지지 않은 부드러운 섬유가 확인되었고, 방사된 섬유의 직경은 각각 0.99 ± 0.02, 1.07 ± 0.02, 1.26 ± 0.03 ㎛였다. 이는 인가전압이 클수록 섬유가 더 굵어진다는 사실을 시사했고, 이는 인가전압이 클수록 섬유가 불안정해지고 쿨롱 척력이 커짐에도 불구하고 방출되는 섬유의 양이 더 많아져서 굵어지는 효과가 더 컸음을 추정해 볼 수 있다.

 

기계적·물리적 특성

섬유성 스캐폴드의 탄성계수와 항복응력을 알아보기 위해 10시간 동안 방사하여 130 ㎛ 두께의 매트를 얻었다. 이렇게 얻어진 섬유성 스캐폴드는 훨씬 짧은 시간(10분; Figure 5 참고)동안 방사한 섬유와 비슷한 형상을 나타냈다. 나노입자가 첨가되지 않은 스캐폴드의 탄성계수는 2.8 ㎫이었던 반면 나노입자가 첨가된 스캐폴드의 탄성계수는 3.6 ~ 3.9 ㎫ 사이였다(Table 1 참고). 흥미롭게도 첨가한 나노입자의 양이 많을수록 탄성계수가 커졌는데, 이는 나노입자의 첨가에 따라 직경이 증가한다는 사실과 일치한다(Table 1 참고). 항복응력과 관련하여 나노입자를 첨가한 대부분의 스캐폴드가 나노입자를 첨가하지 않은 것보다 약간 작은 값을 보였으나 0.5% (w/v) CaCO₃는 예외적으로 약간 높은 값을 가졌다. 게다가 공극의 평균 크기와 공극률 또한 신중하게 조사하였고, 이는 Table 1에 나와 있다. 명백하게 스캐폴드의 평균 공극 크기는 4.3 ~ 5.6 ㎛의 범위 내에 있었다. 또 공극의 정도가 높다는 사실을 공극률이 82 ~ 90%에 육박한다는 사실로부터 확인할 수 있었다.

 

세포독성 평가

간접적인 세포독성 평가가 12% (w/v) PCL, 12% (w/v) PCL + 1.0% (w/v) CaCO₃, 12% (w/v) PCL + 1.0% (w/v) HA에서 SaOS2와 L929을 이용하여 각각 수행되었다. 필자는 뼈-스캐폴딩 상에서의 섬유 매트의 효과를 알아보는 것에 관심이 있지만 L929을 이용한 ISO10993-5 평가 규격은 의무사항이었기 때문에 L929 또한 실험에 응용하였다. Figure 7은 MTT assay를 통한 흡광도 결과를 나타내고 있고, SFM 상에서 배양한 세포들을 컨트롤로 두었다. 명백하게 SaOS2에서는 컨트롤에 비해 PCL, PCL/HA이 비슷한 흡광도를 보였지만 PCL/CaCO₃에서는 약간 작은 흡광도 값을 보였다. 반면에 L929에서는 모든 섬유성 스캐폴드가 컨트롤에 비해 훨씬 큰 값을 보였고, 이 중 PCL/HA가 가장 높은 흡광도를 보였고 PCL/CaCO₃가 그 뒤를 이었다. 위와 같은 결과를 토대로 전기방사한 PCL 섬유와 나노입자를 첨가한 PCL 섬유가 독성이 없으며 뼈-스캐폴드로서 좋은 후보가 될 수 있음을 알 수 있다.

 

결론

이 논문에서 PCL과 CaCO₃ 또는 HA를 첨가한 PCL에 대한 전기방사법을 통해 새로운 뼈-스캐폴딩을 소개하였다. HA는 가수분해 방법으로 성공적으로 합성하였고, 평균적인 입자의 크기는 (관찰을 통해) 230 ㎚정도였다. 방사된 섬유의 점도는 나노입자의 양이 증가함에 따라 같이 증가하는 경향을 보였다. 증가된 점도는 방사된 섬유의 직경의 증가로 이어지는 것으로 여겨졌다. 또 직경의 증가는 섬유 매트의 탄성계수를 증가시키는 것으로 여겨졌다. 더욱이 PCL의 농도가 방사된 섬유의 농도를 크게 증가시켰다. 인가전압의 증가도 PCL/HA 섬유의 직경을 증가시켰다. 마지막으로 방사된 PCL, PCL/CaCO₃, PCL/HA의 매트를 사람의 조골세포(SaOS2), 쥐의 섬유아세포(L929)에서 각각 세포독성 평가를 실시했다. 그 결과 이들 섬유 매트가 뼈-스캐폴드로서 높은 가능성이 있음을 알 수 있었고, PCL/HA가 뼈 세포의 활동을 촉진한다고 알려져 있기 때문에 세 실험군 중에서 PCL/HA가 가장 적합할 것임을 알 수 있었다. 

 

 

입력: 2017.01.11 10:52

 

1. ⓒ Rights and Permissions : 텍스트 인용 사실 없음, 이미지 인용 사실 없음 [본문으로]