【생물학】 세포실험 프로토콜 1강. 세포실험 개요 1부

세포실험 프로토콜 1강. 세포실험 개요 1부

 

추천글 : 【생물학】 세포배양 프로토콜 목차  

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1. 배양의 종류 [본문]

2. 바이오연료 공정 [본문]

3. 균주의 보존 [본문]

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1. 배양의 종류 [목차]

⑴ 회분 배양(batch culture)

① 배지의 양을 한정하여 세포를 생장시키는 것

○ 제한기질(growth-limiting substrate) : 양이 제한돼 있어 세포 생장에 영향을 주는 기질

② 1^st. 정체기(lag phase)

○ 미생물이 새로운 분자들을 인지하고 적응하기 위해, 세포수는 증가하지 않고 내부적인 변화를 가지는 단계

○ 시간단축 전략 : 세포접종 전 배양 환경에 미리 적응, 대사 향상물(예: Mg)·세포인자 농도의 최적화

③ 2^nd. 성장기(대수기, exponential phase)

○ 균형생장(balanced growth) : 모든 세포가 일정한 비율로 증식하는 생장 패턴

○ 세포의 크기가 비교적 일정함 

④ 3^rd. 감속기(deceleration phase)

○ 비균형생장(unbalanced growth)이 시작

⑤ 4^th. 안정기(stationary phase)

○ 세포의 밀도가 유지되는 단계

○ 항생제와 같은 유용 이차 대사산물이 생산되기 시작 (즉, 증식 이외의 대사를 하기 시작)

○ 산소와 영양분이 부족한 단계로, 충분히 산소와 영양분을 공급하면 안정기를 지연시킬 수 있음

⑥ 5^th. 사멸기(death phase) 혹은 쇠퇴기(decline phase)

○ 세포의 밀도가 감소하는 단계

○ 흡광도분석(분광광도계 사용) 시 사멸된 세포를 카운팅하므로 오차가 심함

 

(가)는 생균수 곡선이고 A가 정체기 (출처 : 2014 MEET/DEET I 24번)

Figure. 1. 회분 배양^]

 

⑵ 유가 배양(fed-batch culture)

① 유기영양 성분을 배양 중에 첨가만 할 뿐 배양액을 뽑지 않음으로써 산물의 생산성을 높이는 배양 방법

○ 배양액의 부피가 계속 증가하는 것이 특징

○ 계속해서 공급되는 영양액을 피드(feed)라고 함

② 장점 : 기질 저해 문제 극복

대장균이 포도당을 이용하여 최대 속도로 성장을 하게 되면 부산물인 유기산을 만들게 되며, 이는 성장을 저해하게 된다. 유가식 배양에서는 기질의 농도를 유지하며 대장균의 성장을 적절하게 유지함으로써 부산물의 생산을 줄이고 고농도의 대장균 배양이 가능해진다.

⑶ 연속 배양(chemostat)

① 지속적으로 영양물질을 공급하고 노폐물을 제거하면서 환경조건을 일정하게 유지하는 열린계 상의 배양 방법

② 일반적으로 CSTR(continuous stirred-tank reactor model, 연속 교반반응기)에서 배양

③ 파라미터

○ 세포 밀도(X) : g cells / L

○ 희석률(dilution rate) : 피드(F)를 반응기 부피(V)로 나눈 것으로 정의

○ biomass의 생산성 : D와 X의 곱으로 정의

○ 공간시간 : 반응기에 반응물이 머무는 시간, 반응기 부피(V)를 부피유량(F)으로 나눈 것으로 정의

○ 공간속도 : 공간시간의 역수로서 상대적인 속도 개념

⑷ 기본 방정식

① 파라미터

○ 균체질량 수율(biomass yield) : 단위 질량의 기질당 균체가 얼마나 더 증식할 수 있는지를 나타냄

○ 단위 : g cells / g substrates

○ 일반적으로  Y_x/s로 표시

○ 생산 수율(product yield) : 단위 질량의 기질당 생성물이 얼마나 생성될 수 있는지를 나타냄

○ 단위 : g products / g substrates

○ 일반적으로 Y_p/s로 표시

○ 생산 속도 : 세포 외 생산물의 형성 속도, 단위 질량의 세포당 생성물의 형성속도를 나타냄

○ 단위 : g products / g cells · h

○ 일반적으로 q_p로 표시 

② biomass의 변화율 식

 

 

③ substrates의 변화율 식

 

 

④ products의 변화율 식

 

 

⑤ Monod 식 : 세포 농도가 낮을 때 잘 적용됨

○ Michaelis-Menten 식과 유사한 형태

 

 

○ 잔여 기질 농도(S)는 유입되는 기질 농도(S₀)와 무관

⑥ Contois 식

○ Monod 식을 응용한 형태

 

 

○ 잔여 기질 농도(S)는 유입되는 기질 농도(S₀)와 무관

⑸ cell recycle : chemostat에서 cell recycle이 있으면 dilution rate가 specific growth rate보다 클 수 있음

① 일반적인 현상 : μ = D

② 일반적으로 μ_m < D인 경우 : 세포가 계속 빠져나감

③ 증명

 

 

⑹ 회분식 배양 내 재조합 미생물의 재조합 단백질의 발현양 방정식

 

 

① P : concentration of cloned-gene protein (mg proteins / mg cells)

② t : time(h)

③ k_e : maximum rate of protein synthesis (mg proteins / me cells per hour)

④ p : intracellular plasmid concentration (mg plasmids / mg cells)

⑤ K_t : transcription rate saturation constant (mg / mg cells)

⑥ k_-p : cloned-gene protein denaturation rate constant (1st-order reaction) (h^-1)

⑦ μ : specific growth rate (h^-1)

 

 

2. 바이오연료 공정 [목차]

⑴ 바이오연료 공정은 준비단계(pre-treatment), 당화(saccharification), 발효(fermentation) 순으로 진행

① 준비단계 예 : 셀룰라아제와 헤미셀룰라아제 생산

② 당화 예 : 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 단량체 당으로 전환시키는 가수분해

③ 발효 예 : 육탄당과 오탄당의 발효

⑵ 분리적 가수분해와 발효(SHF, separate hydrolysis and fermentation)

① 준비단계와 당화가 분리된 1단계와 발효처리를 거치는 2단계로 구성된 전통적인 공정

② 장점 : 각 단계가 최적 조건에서 실행되어 전처리된 바이오매스의 세척, 독물제거, 영양물 공급 없이 수행

⑶ 동시적 당화와 발효(SSF, simultaneous saccharification and fermentation)

① 준비단계가 먼저 일어난 후 당화와 발효가 동시에 일어나는 공정

② 장점 1 : 최종산물 억제의 제거로 인해 biomass 가수 분해율이 높음

③ 장점 2 : 전처리된 재료를 세척하면 억제혼합물의 제거로 인해 biomass의 전환률이 향상

④ 장점 3 : 내열성 효모의 사용이 가능

⑷ 병합적 생물공정(CBP, consolidated bio-processing)

① 준비단계, 당화, 발효가 단일 공정으로 처리되는 방식

② 장점 : biomass 분해 효소 생산에 대해 저비용 고효율의 잠재성 제공

 

 

3. 균주의 보존 [목차]

⑴ 균주의 장기간 보존 방법 : 동결보존

참고. -70 ℃ deep freezer, 액체질소 (-196 ℃)

⑵ 균주의 단기간 보존 방법 : agar plate, agar slant 등에 배양 후 냉장 보존(0-5 도)

① agar 분자가 접촉 의존성 생장 억제의 기능을 함

 

입력: 2017.09.09 12:42