【생물학】 세포실험 프로토콜 4강. 접종 및 배양

세포실험 프로토콜 4강. 접종 및 배양

 

추천글 : 【생물학】 세포배양 프로토콜 목차 

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가. 재료 및 시약 [본문]

나. 세포접종 및 배양 [본문]

다. 동결보존법 [본문]

라. 계대배양 [본문]

마. 클린벤치 정리 [본문]

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가. 재료 및 시약 [목차]

 

Ⅰ. 실험 시약 종류

1. DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Sigma Aldrich, USA) : 기본 배지

⑴ 기본적으로 지시약의 기능을 할 수 있어 산성, 중성, 염기성에 따라 노랑, 빨강, 보라색을 띰

⑵ 부착형 세포에 사용함

 

Ingredients	mg/L
INORGANIC SALTS
Calcium chloride dihydrate	265
Ferric nitrate nonahydrate	0.1
Magnesium sulphate anhydrous	97.72
Potassium chloride	400
Sodium chloride	6400
AMINO ACIDS
Glycine	30
L-Arginine hydrochloride	84
L-Cystine dihydrochloride	62.57
L-Glutamine	584
L-Histidine hydrochloride monohydrate	42
L-Isoleucine	105
L-Leucine	105
L-Lysine hydrochloride	146
L-Methionine	30
L-Phenylalanine	66
L-Serine	42
L-Threonine	95
L-Tryptophan	16
L-Tyrosine disodium salt	103.79
L-Valine	94
VITAMINS
Choline chloride	4
D-Ca-Pantothenate	4
Folic acid	4
Nicotinamide	4
Pyridoxal hydrochloride	4
Riboflavin	0.4
Thiamine hydrochloride	4
i-Inositol	7.2
OTHERS
D-Glucose	4500
Phenol red sodium salt	15.9

Table. 1. DMEM의 조성^[각주:1]

 

 

2. RPMI(Rosewall Park Menorial Institute) 

⑴ 미국 Rosewall 연구소에서 개발

⑵ 부유형 세포에 사용함

 

Component	R0883	R1145	R1383	R1780	R2405	R6504	R8758
	[1x] g/L	[10x] g/L	g/L	[1x] g/L	[1x] g/L	g/L	[1x] g/L
Inorganic Salts
Calcium Nitrate • 4H2O	0.1	1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)	0.04884	0.4884	0.04884	0.04884	0.04884	0.04884	0.04884
Potassium Chloride	0.4	4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
Sodium Bicarbonate	2	—	—	2	2	—	2
Sodium Chloride	6	60	6	6	6	6	6
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	0.8	8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
Amino Acids
L-Alanyl-L-Glutamine	—	—	—	—	0.4344	—	—
L-Arginine	0.2	2	0.2	—	0.2	0.2	0.2
L-Asparagine (anhydrous)	0.05	0.5	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
L-Aspartic Acid	0.02	0.2	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
L-Cystine • 2HCl	0.0652	0.652	0.0652	0.0652	0.0652	0.0652	0.0652
L-Glutamic Acid	0.02	0.2	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
L-Glutamine	—	—	0.3	0.3	—	0.3	0.3
Glycine	0.01	0.1	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
L-Histidine	0.015	0.15	0.015	0.015	0.015	0.015	0.015
Hydroxy-L-Proline	0.02	0.2	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
L-Isoleucine	0.05	0.5	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
L-Leucine	0.05	0.5	0.05	—	0.05	0.05	0.05
L-Lysine • HCl	0.04	0.4	0.04	—	0.04	0.04	0.04
L-Methionine	0.015	0.15	0.015	0.015	0.015	0.015	0.015
L-Phenylalanine	0.015	0.15	0.015	0.015	0.015	0.015	0.015
L-Proline	0.02	0.2	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
L-Serine	0.03	0.3	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03
L-Threonine	0.02	0.2	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
L-Tryptophan	0.005	0.05	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
L-Tyrosine • 2Na • 2H2O	0.02883	0.2883	0.02883	0.02883	0.02883	0.02883	0.02883
L-Valine	0.02	0.2	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
Vitamins
D-Biotin	0.0002	0.002	0.0002	0.002	0.002	0.0002	0.0002
Choline Chloride	0.003	0.03	0.003	0.003	0.003	0.003	0.003
Folic Acid	0.001	—	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
myo-Inositol	0.035	0.35	0.035	0.035	0.035	0.035	0.035
Niacinamide	0.001	0.01	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
p-Aminobenzoic Acid	0.001	0.01	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
D-Pantothenic Acid (hemicalcium)	0.00025	0.0025	0.00025	0.00025	0.00025	0.00025	0.00025
Pyridoxine • HCl	0.001	0.01	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
Riboflavin	0.0002	0.002	0.0002	0.0002	0.0002	0.0002	0.0002
Thiamine • HCl	0.001	0.01	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
Vitamin B12	5E-06	0.00005	5E-06	5E-06	5E-06	5E-06	5E-06
Other
D-Glucose	2	20	—	2	2	2	2
Glutathione (reduced)	0.001	0.01	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
Phenol Red • Na	0.0053	0.053	0.0053	—	0.0053	0.0053	0.0053
Add
L-Glutamine	0.3	0.3 at 1×	—	—	—	—	—
Sodium Bicarbonate	—	2.0 at 1×	2	—	—	2	—

Table. 2. RPMI의 조성^[각주:2]

 

3. NBCS(New Born Calf Serum, Sigma Aldrich, USA) : 증식용 배지에 쓰임

4. FBS(Fetal Bovine Serum, Sigma Aldrich, USA) : 분화용 배지, 일부 증식용 배지에 쓰임

5. PS(Penicillin Streptomycin, Sigma Aldrich, USA) : 항생제 및 항진균제를 지칭

6. DPBS(Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline, Sigma Aldrich, USA) 

⑴ 세척(washing) 시 쓰는 식염수 같은 용액

⑵ 잔존 배지 및 노폐물이 새로운 배지 및 시료를 억제하는 것을 방지함

⑶ PBS와의 차이 : 세포 부착에 관여하는 Mg²⁺, Ca²⁺ 등이 제거되어 세포가 더 쉽게 떼어질 수 있게 함 

7. DMSO(dimethyl sulfoxide) 

⑴ 호일로 감싸서 보관, 동결용 배지, MTT assay, WST assay

⑵ DMSO는 얼음 결정의 형성을 억제

8. Trypsin-EDTA

⑴ EDTA의 역할 : 세포 부착에 관여하는 Mg²⁺, Ca²⁺ 등을 붙잡아 세포가 더 쉽게 떼어질 수 있게 함

 

Ⅱ. 배양 기구 종류

1. 클린벤치(clean bench)

2. CO₂ 인큐베이터(CO₂ incubator)

3. 항온수조(water bath)

4. 원심분리기(centrifuge)

5. 현미경(microscope)

6. 액화 질소 (nitrogen freezer)

7. 피펫(pipette), 마이크로피펫(micropipette), 멀티 피펫(multi pipette)

8. 혈청용 피펫(serological pipette), 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)

9. 피펫 에이드(pipette aid), 피펫 필러(pipette filler)

10. culture plate : TCPS(tissue culture polystyrene) 등

⑴ polystyrene 등은 일반적으로 약한 음전하를 띠고 있어 세포들이 기질에 잘 부착하도록 함

11. multi-well plate

12. bottle top filter

13. hemacytometer

14. 큐벳(cuvette)

⑴ 정의 : 액상 시료의 분광 스펙트럼 획득 시 이용되는 시료 용기

⑵ 치수 : 1-10 mm

⑶ 종류 1. 석영 (170-2,700 nm spectral range), 용융 실리카, 규산염 유리

⑷ 종류 2. 플라스틱 (340-900 nm). 모든 플라스틱 큐벳이 균일하지 못함

 

Ⅲ. 팁 정리

마이크로 피펫(Micro-pipette)의 끝 부분에 끼워서 시료를 빨아 올리는 데 사용되는 팁은 반드시 깨끗한 상태임이 보증돼야 한다. 일회용으로 사용하고 용액이 바뀌거나 끝이 애먼 데에 닿았을 경우 반드시 바꿔 끼우는 것도 그런 이유이다. 하지만 시중에 나온 팁은 깨끗한 상태가 아니므로 실험자는 스스로 팁을 멸균해서 사용해야 한다.

 

1. 구입한 팁들을 팁 랙에 꽂아 넣는다.

2. 해당 랙을 호일로 감싼다.

⑴ 증류수의 경우 병에 넣고, 병을 열어놓은 채로 호일로 감싼다.

3. 호일에 종이 테이프를 붙인다.

4. 고압 멸균기에 적당량의 물을 넣는다.

5. 고압 멸균기에 랙을 넣고 스위치를 켠다.

6. 멸균을 마치고 계기가 저압상태인 것을 확인한 뒤 증발기에 넣고 말린다.

⑴ 멸균을 하면 종이 테이프의 색깔이 변해 있다.

7. 말려진 팁과 랙은 이제 실험상에서 이용할 수 있다.

 

Ⅳ. 디쉬별 미디어 정리

 

	Surface Area (cm2)	Seeding Density (× 106)	Cells Confluency (× 106)	Trypsin-EDTA (mL)	Grouth Media (mL)
Flask
T-25	25	0.7	2.8	0.5	3-5
T-75	75	2.1	8.4	1-2	8-15
T-175	175	5.0	20.5	4-8	15-30
Dish
60 mm	21	0.8	3.2	0.5	3
100 mm	55	2.2	8.8	1-2	10
150 mm	152	5.0	20.0	4	20
Plate
6-well	9.6	0.3	2	2	2-5
12-well	3.9	0.1	1	1	2-4
24-well	1.9	0.05	0.5	0.5	0.5-1.5
48-well	1.0	0.025	0.25	0.3	0.5-1.0
96-well	0.3	0.01	0.1	0.1	0.025-0.34
(F-Bottom)

Table. 3. 디쉬별 미디어 정리

 

 

나. 세포접종 및 배양 [목차]

Ⅰ. 배지 제작

배지는 세포의 유일한 영양공급원이다. 이와 같은 배지를 제작하는 방법을 살펴보자.

1. 배지의 성분

⑴ 기본 배지(media) : 부착형(DMEM low-glucose, DMEM high-glucose, α-MEM), 부유형(RPMI)

① α-MEM : 보통 줄기세포 배양 시에 사용함

② BME : Eagle's basal medium

③ DMEM : Dulbecco's modified Eagle's medium 

④ GMEM : Glasgow MEM (BHK 21)

⑤ IMDM : Iscove's modified Dulbecco's medium

⑥ L-15 : Leibovitz's L-15 medium

⑦ Mc 5A : McCoy's 5A medium (modified)

⑧ M199 : Medium 199

⑨ MEM : Minimum essential medium

⑩ F-10 : Nutrient mixture Ham's F-10 

⑪ F-12 : Nutrient mixture Ham's F-12

⑫ RPMI : RPMI 1640 medium

⑬ Wmth : Waymouth's Medium 752/1

⑭ CMRL 1066 

⑵ 혈청(serum)

① 기본 배지보다 더 주요한 영양 공급원

② 분화배지는 FBS, 성장배지는 BCS로 하나 FBS를 성장배지로 사용해도 무관

⑶ 항생제 : PS(penicillin streptomycin)

2. 증식용 배지(PM, proliferation medium) : 100% 기본배지 + 10% 혈청 + 1% 항생제

⑴ 3T3-L1 (성장) : DMEM 100% + BCS 10% + PS 1%

⑵ 3T3-L1 (분화) : DMEM 100% + FBS 10% + PS 1% 

⑶ TM(Tympanic Membrane) 세포 : DMEM low-glucose 100% + FBS 10% + PS 1%

⑷ MC-3T3 : DMEM high-glucose 100% + FBS 10% + PS 1%

3. 동결용 배지

⑴ 제작법 1. 증식용 배지 + 10 ~ 20% DMSO 또는 글리세롤 + (10% 혈청)

① 혈청을 20% 넣는 경우 생존율이 높아지는 경우가 있어서 혈청을 추가로 넣어주기도 함

⑵ 제작법 2. RPMI 1640 52.5% + FBS 40% + DMSO 7.5% (KCLB 참고)

① 3T3-L1 실험에서 이 방법을 사용

⑶ 제작법 3. RPMI 1640 60% + FBS 30% + DMSO 10%

① HC11 cell line에서 이 방법을 사용

⑷ 제작법 4. α-MEM 60% + FBS 30% + DMSO 10%

① TM 세포, MC-3T3 실험에서 이 방법을 사용

⑸ DMSO는 물이 얼면 생기는 육각 결정으로 인한 세포 손상을 막아 준다.

⑹ DMSO 자체는 세포독성이 있다. (동결상태에서는 화학반응이 극히 저하됨)

⑺ DMSO는 빛에 민감하다.

 

Ⅱ. 기본적인 스킬

프로토콜을 익히는 것뿐만 아니라 기본적인 스킬을 잘 수행하는 것도 중요하다.

 

1. inverting

2. locking

3. shaking

4. morphology check

5. confluency check

 

Ⅲ. 동결세포 분주 프로토콜

세포주 은행에서 세포가 동결된 상태로 오기 때문에 해동하는 과정이 필요하다. 또한 동결용 배지가 세포에 독성이 있어 서둘러 배지를 교체하는 과정도 요구된다. 그 프로토콜은 다음과 같다.

 

1. 동결용 배지에 독성이 있기 때문에 아래의 과정을 신속하게 진행하면 좋다.

⑴ (참고) 얼리는 것은 느리게 진행하면 좋다.

2. 증식용 배지를 37 ℃의 항온수조(water bath)에서 예열한다. (1시간 ~ 2시간 정도)

⑴ 예열 기간이 길수록 좋기 때문에 2시간이 더 좋음

3. 예열한 증식용 배지 등에 70% 에탄올을 뿌린 뒤 클린벤치(clean bench)에 넣기

4. -196 ℃ 액화질소 탱크에서 동결보관된 세포를 꺼낸다.

⑴ 동결보관된 세포 현탁액의 양은 대략 1 ㎖이다.

5. 동결된 세포가 들어 있는 크라이오 튜브(cryo-tube)를 해동한다.

⑴ 해동하는 방법은 항온수조를 이용하거나 손으로 녹이는 방법이 있다.

⑵ 항온수조에서 해동할 시 튜브의 뚜껑에 물이 닿지 않도록 주의한다.

⑶ 튜브 안의 세포 현탁액이 모두 흐를 정도가 될 때까지이다. (10 ~ 20 초 소요)  

6. 크라이오 튜브를 클린벤치에 반입한 뒤 5 ㎖의 증식용 배지가 담긴 피펫으로 함께 피펫팅을 함 (10회 정도)

⑴ 증식용 배지는 동결용 배지에 있는 DMSO를 희석하는 역할이므로 넣는 양이 많을수록 좋다.

7. 15 ㎖ 코니컬 튜브에 cryo tube의 세포 현탁액이 섞인 6 ㎖의 용액을 넣고 추가로 5 ㎖의 fresh media를 그 코니컬 튜브에 넣어줌

8. 그 튜브를 원심분리기로 1100 rpm, 4분 동안 돌린다. (일반적으로 자동 셋팅이 돼 있음)

⑴ 원심분리를 하고 나면 세포로 이루어진 하얀 침전물(cell pellet)이 튜브의 바닥에 가라앉아 있는 것을 볼 수 있다.

⑵ 3T3-L1과 같은 세포의 경우 부착이 빠르기 때문에 DMSO를 제거하기 위해 원심분리를 하지 않아도 됨

⑶ 그 결과 전지방 세포 실험에서 이 프로토콜을 사용하지 않음

9. 배양할 용기에 증식용 배지를 미리 넣는다.

⑴ 150π 배양 접시(culture dish)의 경우 14 ㎖를 넣는다.

⑵ 90π 배양 접시의 경우 9 ㎖를 넣는다.

⑶ T-25 플라스크의 경우 5 ㎖를 넣는다.

⑷ T-75 플라스크의 경우 8-15 ㎖를 넣어주면 돼므로 11 ㎖ 정도의 배지를 미리 넣어 둠

⑸ 배양 접시는 코팅이 돼 있다는 점에서 패트리디쉬(petridish)와 다르다.

10. 원심분리가 끝난 뒤 세포 침전물이 손상되지 않도록 주의한 채 상층액을 제거한다.

⑴ 상층액 제거 시 거품부터 제거하도록 한다.

11. 상층액이 제거된 튜브에 1 ㎖의 증식용 배지를 넣고 피펫으로 섞어준다. (re-suspension)

12. 그 뒤 세포 현탁액을 앞의 배양할 용기에 넣는다.

13. 세포를 넣어도 골고루 퍼져 있지 않을 가능성이 높으므로 골고루 퍼지도록 용기를 흔든다.

⑴ 골고루 퍼지게 하기 위해 CO₂ 인큐베이터의 선반에 올려놓고 3-4번 흔들어주기도 함

14. 세포가 담긴 용기를 37 ℃, 습윤, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터(Incubator)에 보관한다.

⑴ CO₂ 인큐베이터는 배양액의 pH를 조절하는 역할을 한다.

⑵ CO₂ 공급이 차단되면 배양액의 pH는 높아진다.

15. 클린벤치 내부 또는 suction 장치에 에탄올 소독을 함

16. (선택) 2 ~ 3시간 정도 인큐베이션 한 뒤 배지를 모두 제거한다. (suction) 

⑴ 제거하는 과정에서 떠 있는 죽은 세포들도 제거된다.

17. 24시간 후 배지를 교환함

 

Ⅳ. 배지 교환

배지는 세포에 영양을 공급하고 항생기능 및 항진균기능을 수행한다. 시간이 지나면 배지는 영양이 떨어지고 대사 부산물로 인해 산성화되므로 2 ~ 3일에 한 번은 배지를 교환해야 한다. 또한 계대배양을 하고 하루가 지난 뒤에도 배지를 교환해야 한다. 

1. 증식용 배지를  37 ℃의 항온수조(Water Bath)에서 예열한다. (10분 ~ 15분 必)

2. 배양 용기를 기울여 배지를 한쪽으로 쏠리게 한 뒤 모두 제거한다.

⑴ 바닥에 붙어 있는 세포를 건들지 않도록 주의한다.

3. (생략 가능) PBS를 약 10 ㎖ 정도 넣고 배양 용기를 흔들어 준다.

4. PBS를 제거하고 증식용 배지를 넣는다.

⑴ 150π 배양 접시(Culture Dish)의 경우 15 ㎖를 넣는다.

⑵ 90π 배양 접시의 경우 10 ㎖를 넣는다.

⑶ T-25 플라스크의 경우 6 ㎖를 넣는다.

5. 세포가 담긴 용기를 37 ℃, 습윤, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터(Incubator)에 보관한다.

 

 

다. 동결보존법 [목차]

세포를 저장해 두고자 한다면 얼리는 게 좋다. 그게 동결보존이다.

 

1. 클린 벤치(Clean Bench) 내부의 광원을 끈다.

⑴ 동결용 배지는 빛에 민감하다.

2. 배지를 모두 제거한다.

3. DPBS로 1 ~ 2회 세척한다.

⑴ 목적 : 이후에 사용될 트립신의 억제제로 작용할 수 있는 FBS를 제거하기 위한 과정

⑵ 골고루 섞일 수 있도록 앞뒤로, 좌우로 흔들어준다.

⑶ 150π 배양 접시의 경우 10 ㎖ 이상을 넣는다.

⑷ 90π 배양 접시의 경우 7 ㎖ 이상을 넣는다.

4. Trypsin-EDTA가 배양 용기 표면을 간신히 잠기게 할 정도만 첨가한다. (효소는 양이 중요한 게 아님)

⑴ 트립신(trypsin)은 단백질분해효소로서 세포의 ECM을 잘라준다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 4 ㎖를 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 3 ㎖를 넣는다.

⑷ T-25 플라스크의 경우 2 ㎖를 넣는다.

5. 배양 용기를 4분 2분 간 인큐베이터에 보관한다.

⑴ 너무 오래 인큐베이터에 보관하면 세포 자체가 분해되므로 좋지 않음

6. 세포가 탈착된 것을 현미경으로 확인한다.

7. 배양 용기에 있는 세포 현탁액을 코니컬 튜브에 옮겨 담는다.

8. 코니컬 튜브를 원심분리기에서 4 분 동안 1100 rpm으로 돌려준다.

9. 기다리는 동안 1만큼 높인 Passage 넘버와 날짜, 실험자, 세포 종류를 메모한다.

⑴ Passage 넘버는 처음 추출한 시점을 기준으로 세포에 트립신을 처리해 준 횟수를 의미한다.

10. 세포 침전물이 손상되지 않도록 주의한 채 상층액을 제거한다.

⑴ 상층액 제거 시 거품부터 제거하도록 한다.

11. 상층액이 제거된 튜브에 동결용 배지를 넣고 피펫으로 섞어준다.

⑴ 배지의 양은 설정한 세포의 밀도에 따라 달라질 수 있다.

⑵ 동결시키는 세포의 밀도는 106 cells / ㎖보다 높아야 한다.

12. 그 뒤 세포 현탁액을 1 ㎖씩 크라이오 튜브에 분주한다.

13. (생략 가능) 분주한 세포를 미리 냉동고에서 냉각한 BICELL에 담은 후 4 ℃에서 2시간 냉각시킨다.

14. 그 뒤 크라이오 튜브를 초저온 냉동고(Freezer)의 맨 밑으로 옮겨 밤새(Overnight) 기다린다.

⑴ 초저온 냉동고는 1분에 1 ℃씩 떨어지도록 한다.

⑵ 초저온 냉동고에 보존 시 IPA(Isopropyl Alcohol)에 담긴 통에 보관한다. 

① Isopropyl Alcohol Box는 5번 개봉할 때마다 1번씩 교체해 주는 것이 좋다.

② Isopropyl Alcohol은 freezing rate가 moderate하므로 자주 사용된다.

15. 튜브를 빠르게 액체 질소 용기에 옮겨 담는다.

⑴ 이동 시 액체질소에 담아 이동하는 것이 이상적이다.

 

 

라. 계대배양 [목차]

세포가 배양 용기 표면에 꽉 차면(Confluence) 세포 분열에 방해되어 증식에 영향을 주고 심하면 세포가 모두 죽기도 한다. 따라서 적절한 시기(80~90% confluent)에 계대배양을 하면서 관리를 해주어야 한다. 다음은 일반적인 1 : 3의 프로토콜이다.

 

1. 배양 용기에 있는 상층액을 제거한다.

2. DPBS로 1 ~ 2회 세척한 뒤 제거한다.

⑴ DPBS는 생리식염수와 유사한 것으로 노폐물 제거 및 혈청 희석의 역할을 한다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 10 ㎖ 이상을 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 7 ㎖ 이상을 넣는다.

3. 트립신(Trypsin)-EDTA가 배양 용기 표면을 간신히 잠기게 할 정도만 첨가한다. (효소는 양이 중요한 게 아님)

⑴ 트립신은 단백질분해효소로서 세포의 ECM을 잘라준다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 4 ㎖를 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 3 ㎖를 넣는다.

⑷ T-25 플라스크의 경우 2 ㎖를 넣는다.

4. 배양 용기를 4분 2분 간 인큐베이터에 보관한다.

⑴ 너무 오래 인큐베이터에 보관하면 세포 자체가 분해되므로 좋지 않음

5. 배양 용기를 꺼낸 뒤 탁탁 쳐 준다.

6. 세포가 탈착된 것을 현미경으로 확인한다.

7. 배양 용기에 있는 세포 현탁액을 코니컬 튜브에 옮겨 담는다.

⑴ 세포가 간신히 붙어 있는 경우가 잦기 때문에 세포 현탁액을 용기 바닥면에 골고루 뿌려주어야 한다.

8. 그 뒤 튜브에 증식용 배지를 약 3배 가량 넣는다

⑴ 혈청이 첨가된 배지는 트립신-EDTA의 활성을 억제한다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 12 ㎖를 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 9 ㎖를 넣는다.

⑷ T-25 플라스크의 경우 7 ㎖를 넣는다.

9. 코니컬 튜브를 원심분리기에서 4 분 동안 1100 rpm으로 돌려준다.

10. 기다리는 동안 배양 용기를 준비하고, 1만큼 높인 passage 넘버와 날짜, 실험자, 세포 종류를 메모한다.

11. 세포 침전물이 손상되지 않도록 주의한 채 상층액을 제거한다.

⑴ 상층액 제거 시 거품부터 제거하도록 한다.

12. 세포 침전물에 1 ㎖의 증식용 배지를 넣고 섞어준다.

13. 배양할 용기에 증식용 배지를 미리 넣어놓는다.

⑴ 150π 배양 접시(Culture Dish)의 경우 14 ㎖를 넣는다.

⑵ 90π 배양 접시의 경우 9 ㎖를 넣는다.

⑶ T-25 플라스크의 경우 5 ㎖를 넣는다.

14. 그 뒤 333 ㎕씩 세포 현탁액을 배양 용기에 넣는다.

15. 세포가 골고루 섞일 수 있도록 배양 용기를 앞뒤로, 좌우로 흔든다.

16. 세포가 담긴 용기를 37 ℃, 습윤, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터(Incubator)에 보관한다.

 

Useful_Numbers_Y14472_Useful_Nmbrs.pdf

 

 

 

마. 클린벤치 정리 [목차]

클린벤치 상에서 세포실험이 끝나면 적절하게 클린벤치를 정리해 주어야 한다.

 

1. 세포실험을 하면서 생긴 쓰레기들을 클린벤치 밖에 있는 쓰레기통에 넣어준다.

2. 세포실험에 사용한 용액들을 파라필름으로 감은 뒤 꺼내서 냉장실 및 냉동실에 넣어준다.

⑴ 파라필름은 박테리아 및 진균류가 해당 용액을 침투하는 것을 막아준다.

3. 적절한 용기에 70% 알코올을 담은 뒤 클린벤치 안에서 석션기의 호스 내부를 청소한다.

⑴ 100% 알코올은 증발속도가 빨라 물 30%를 섞은 70% 알코올보다 살균능력이 덜 하다.

4. 핸드 타월에 70% 알코올을 묻힌 뒤 클린벤치 내부를 닦아준다.

5. 마이크로 피펫은 표시된 범위에서 최대 값으로 맞춰 놓고, 피펫 에이드는 충전기에 꽂아 넣는다.

⑴ 마이크로 피펫에서 작은 눈금은 용수철이 늘어난 상태를 의미하는데, 이 상태가 오래 지나면 용수철의 탄성이 줄어든다.

6. 세포가 묻은 폐시료들은 (2% 락스 등으로) 락스칠한 뒤 30분 정도 기다린 뒤 쓰레기통에 버릴 수 있다.

7. 쓰레기통 내 쓰레기가 차면 이를 정규 규격의 봉지 및 상자에 담아 쓰레기장에 버린다.

 

입력: 2013.12.25 02:55