【생물학】 세포실험 프로토콜 5강. 셀 카운팅과 웰 분주

세포실험 프로토콜 5강. 셀 카운팅과 웰 분주

 

추천글 : 【생물학】 세포배양 프로토콜 목차 

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가. 셀 카운팅 [본문]

나. 웰 분주 [본문]

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가. 셀 카운팅(cell counting) [목차]

먼저 웰 플레이트(Well Plate)에 분주할 때 세포의 수를 일정하게 처리해 줄 필요가 있다. 따라서 웰 분주(Well Seeding)를 하기 전 세포수 계산을 해야 한다. 최근에는 셀 카운팅 작업이 다양한 cell counter에 의해 자동화되었다. (예 : EVE automated cell counter from nanoentek. inc) 

 

1. 배양 용기에 있는 상층액을 제거한다.

2. DPBS로 1 ~ 2회 세척한 뒤 제거한다.

⑴ DPBS는 생리식염수와 유사한 것으로 노폐물 제거 및 혈청 희석의 역할을 한다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 10 ㎖ 이상을 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 7 ㎖ 이상을 넣는다.

3. 트립신(Trypsin)-EDTA가 배양 용기 표면을 간신히 잠기게 할 정도만 첨가한다. (효소는 양이 중요한 게 아님)

⑴ 트립신은 단백질분해효소로서 세포의 ECM을 잘라준다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 4 ㎖를 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 3 ㎖를 넣는다.

⑷ T-25 플라스크의 경우 2 ㎖를 넣는다.

4. 배양 용기를 4분 간 인큐베이터에 보관한다.

5. 세포가 탈착된 것을 현미경으로 확인한다.

6. 배양 용기에 있는 세포 현탁액을 코니컬 튜브에 옮겨 담는다.

⑴ 세포가 간신히 붙어 있는 경우가 잦기 때문에 세포 현탁액을 용기 바닥면에 골고루 뿌려주어야 한다.

7. 현탁액을 원심분리하여 침전시킨다.

8. 침전된 세포에서 상층액을 제거하고 새로운 배양액을 첨가하여 세포 현탁액 10 ㎖를 만든다.

9. 세포현탁액 10 ㎕를 마이크로 피펫(Micro-pipette)을 통해 건져낸 뒤 EP 튜브에 넣는다.

10. 0.4 % 트리판 블루(Trypan Blue) 용액 10 ㎕를 해당 EP 튜브에 넣고 10분 동안 회전(Vortex)시킨다.

⑴ 살아있는 세포는 트리판 블루를 흡수하지 못하므로 하얗게 보임

⑵ 죽어있는 세포만 트리판 블루로 염색되므로 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분할 수 있음

11. 튜브 안에 있는 10 ㎕ 용액을 헤마사이토미터(혈구계수기, Hemocytometer)에 넣는다.

12. 헤마사이토미터를 광학현미경으로 관찰한다. 대물렌즈의 배율은 ×10으로 한다.

13. 광학현미경 관찰 방법

 

출처 : 2011 MEET/DEET 자연과학 I

Figure. 1. 헤마사이토미터를 관찰한 모습^]

 

 

Figure. 2. 헤마사이토미터 계산을 위한 구역 설정

 

⑴ 헤마사이토미터의 치수는 1 ㎜ × 1 ㎜ × 0.1 ㎜ (높이)이다.

⑵ 세포 개수는 R 구역을 통해 계산하거나 W 구역(a₁, a₂, a₃, a₄)을 계산하는 방법이 있다.

⑶ W 구역의 공식

 

 

① 경계선에 걸친 것은 ㄱ 자 혹은 ㄴ 자에 해당하는 모서리 부분만 세는 것으로 사전에 결정한다.

② 희석계수(dilution coefficient) : 용액(sol)에 대한 트리판 블루 + 용액(sol·trp)의 부피비, 즉 2이다.

⑷ 예제

① 세포 현탁액에는 1 ml의 medium이 있음 

② 세포 현탁액 20 ㎕를 덜어 trypan blue 20 ㎕와 섞음 

③ 그 중 10 ㎕를 덜어 헤마사이토미터로 관찰한 결과 4칸에서 216개 관찰

④ 계산 

 

 

14. 셀 카운팅 유의사항

⑴ 세포들이 single cell로 분리되도록 할 것

⑵ 적절한 dilution을 할 것 : 100 ~ 300 cells / 5 squares가 적절함

⑶ 헤마사이토미터에 적정량만큼 채울 것

 

 

나. 웰 분주(well seeding) [목차]

세포수 계산이 선행되어야 한다.

 

Figure. 3. 웰 분주

 

1. 코니컬 튜브에 세포현탁액을 넣고 리서스펜션을 하여 세포의 밀도를 균일하게 만든다. 

2. 미리 웰에 증식용 배지를 넣어둔다.

⑴ 6 웰 플레이트의 경우 2 ㎖를 넣는다.

⑵ 96 웰 플레이트의 경우 200 ㎕를 넣는다.

3. 적당한 수의 세포가 들어가도록 잘 분배하여 웰에 세포 현탁액을 넣는다.

⑴ 6 웰 플레이트의 경우 50,000 cells가 들어가도록 한다.

⑵ 96 웰 플레이트의 경우 1,000 ~ 3,000 cells가 들어가도록 한다.

4. 별도의 컨트롤(Control; Blank)을 두어 세포만 없이 배지만 있는 빈 웰을 만든다.

 

입력: 2013.12.29 02:46