【생물학】 면역분석법

면역분석법(immunoassay)

 

추천글 : 【생물학】 37강. 생물학 실험

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1. 면역침전법 [본문]

2. 방사면역분석법 [본문]

3. 면역조직화학법 [본문]

4. 3차원 면역염색법 [본문]

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1. 면역침전법(immunoprecipitation) [목차]

⑴ 개요

① 정의 : 항원-항체 반응을 이용하여 특정 항원 물질을 침전시켜 분리해 내는 방법

② 다음은 염색질 면역침전법(ChIP)의 과정을 기술하고 있음

③ 전제 : 사람 세포에서 단백질 X와 Y는 DNA 부위 ⓐ에 결합함

④ 목적 : 물질 M이 그 결합에 미치는 영향을 알아보기 위함

⑵ 단계 1. 특정 물질 M을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에 포름알데히드를 10분 동안 처리

⑶ 단계 2. 10분 동안 처리하고, 염색질 DNA의 크기가 250 bp가 되도록 절단

⑷ 단계 3. 위 시료를 동일한 양만큼 취한 뒤 각각 항-X 또는 항-Y 항체를 넣고 반응시킴

① X와 Y는 DNA 부위 ⓐ에 결합한다고 가정

⑸ 단계 4. 1차 침전물 : protein A 아가로스로 반응물을 침전시킴

⑹ 단계 5. 1차 침전물 각각의 절반을 DTT로 처리하여 염색질 복합체를 분리함

⑺ 단계 6. 위 염색질 복합체에 항-X 또는 항-Y 항체를 넣고 반응시킴

⑻ 단계 7. 2차 침전물 : protein A 아가로스로 반응물을 침전시킴

⑼ 단계 8. 단계 2의 염색질 DNA와 동일 양의 1차 및 2차 침전물로부터 DNA를 분리함

⑽ 단계 9. 위 DNA에 대해 PCR과 아가로스 겔 전기영동을 통해 ⓐ의 존재 여부를 확인

 

출처 : 2020 MEET/DEET 자연과학 I

Figure. 1. 면역침전법의 결과 예시^]

(나)는 단계 3 + 단계 4를, (라)는 단계 6 + 단계 7을 나타냄

 

① 결과 1. DNA 부위 ⓐ에 단백질 Y만 결합할 수 있음

② 결과 2. 단백질 Y 위에 단백질 X가 결합할 수 있음

③ 결과 3. 물질 M은 단백질 X와 단백질 Y의 결합을 억제함

 

 

2. 방사면역분석법(RIA, radioimmunoassay) [목차]

⑴ 개요

① 정의 : 표지된 항원과 표지되지 않은 항원을 결합시켜 경쟁을 유도하는 원리

② 경쟁결합 면역분석법의 한 형태

 

 

3. 면역조직화학법(IHC, immuno-histochemistry) [목차]

⑴ 단계 1. 영구조직표본화(tissue prep)

① 조직 시료를 슬라이드상에 포르말린으로 고정

○ 포르말린은 포름알데히드 수용액으로서 고정액(fixative)이라고도 불림

○ 조직 내 라이소자임과 프로테아제로 인해 조직은 흐물흐물한 상태가 됨

○ 포르말린은 단백질 간의 교차 연결을 생성하여 조직의 상태를 유지시켜 줌

② 탈수 : 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올을 순차적으로 처리

③ 자일렌을 처리하여 에탄올과 파라핀이 잘 섞이도록 해줌

④ 경화 : 파라핀을 처리하여 조직을 경화

○ 파라핀은 조직을 썩지 않게 해줌

○ (참고) 조식 처리법 : 파라핀 처리, 동결 처리

⑤ 자일렌을 처리하여 파라핀을 제거

⑥ 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올을 순차적으로 처리

⑵ 단계 2. 항원 노출(epitope retrieval)

① 시트르산 완충용액을 넣어 가열 : 항원을 노출시키는 과정

⑶ 단계 3. 사전 처리(blocking)

① 준비된 조직 슬라이드를 3 % 과산화수소수(H₂O₂)에서 10분간 반응

○ 조직 내에 존재하는 과산화효소의 활성을 약화하는 과정

② PBS로 세척한 후 정상 염소 혈청(FBS)과 20분간 반응

○ PBS(phosphate buffered saline)은 세척액으로서 기능

○ 염소 혈청은 항원-항체 응집에서 비특이적 결합을 줄임

⑷ 단계 4. 항원-항체 응집반응

① 조직을 생쥐 유래 1차 항체와 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 세척

○ 1차 항체는 관심 있는 항원에 대한 항체임

○ 조직의 종(예 : 사람)은 1차 항체의 유래종(예 : 생쥐)과 다른 종이어야 함

② 염소 유래 2차 항체와 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척

○ 2차 항체는 1차 항체에 대한 항체임

○ 2차 항체를 쓰는 이유 : 혼성화에 참가하는 항체의 수를 늘려 신호를 증폭하기 때문

 

 

 

	direct method	indirect method	combined method
정의	2차 항체를 쓰지 않음	2차 항체를 씀	두 방법을 혼합
장점	빠름. 단일 단계 여러 항체 사용 가능	이차 항체의 신호증폭 한 이차 항체가 여러 일차 항체에 결합 가능	이차 항체의 신호 증폭 여러 항체 사용 가능
단점	신호가 미미함	2단계 반응 다른 숙주의 항체 필요	다중 단계 반응

Figure. 2. 2차 항체를 쓰는 이유 (ref)^]

 

○ 2차 항체의 요건 : 조직의 종과 1차 항체의 유래종은 2차 항체의 유래종 (예 : 염소)과 다른 종이어야 함

○ 2차 항체의 선택

○ 일반적으로 특정 종의 항체의 구조는 공통적이기 때문에 2차 항체는 값이 저렴한 IgG에 대한 항체를 사용함

○ 2차 항체는 항체의 Fc 부분을 타겟팅하는 것과 Fab 부분을 타겟팅하는 게 있음

○ 구조가 비교적 일정한 Fc 부분을 타겟팅하는 2차 항체를 많이 사용함

○ 위 조건의 경우 anti-IgG antibody (reactivity : 생쥐, host : 사람, 생쥐만 아니면 됨)

⑸ 단계 5. 신호 획득

① 방법 1. 비오틴-스트렙트아비딘 반응 후 DAB 산화반응

○ 5-1. 비오틴(biotin)이 부착된 2차 항체를 사용

○ 비오틴이 포함된 조직의 경우 거짓양성의 결과가 나올 수 있음

○ 5-2. 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘과 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척

○ 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘 : streptavidin-HRP 

○ HRP(hrp protein) : horseradish peroxidase 

○ 스트렙트아비딘은 비오틴과 100 % 결합

○ 5-3. DAB(3,3'-diaminobenzidine)와 반응시켜 발색시킴

○ DAB + 과산화수소 + 과산화효소 → DAB 산화

○ DAB가 산화되면 방향족성을 가지면서 가시광선 흡수 (즉, 색깔을 띰)

○ 비오틴, 스트렙트아비딘은 〈과산화효소 + 항원〉을 만들어주기 위함

○ 5-4. 이후에 필요하면 대조염색을 할 수 있음

○ 예 : 헤마톡실린(Mayer hematoxylin)으로 1분간 염색 (핵 염색 목적)

○ 5-5. 현미경으로 관찰

② 방법 2. 1차 항체와 달리 2차 항체에 형광을 붙여 신호를 관찰할 수도 있음 

○ 형광 물질의 종류

○ TSA signal amplification : indirect IHC 중 하나

③ 방법 3. 기타 방법

○ beta-galactosidase : X-gal을 기질로 하여 푸른색 생성물을 생성

○ alkaline phosphate : pH 10.5 정도의 알칼리성 환경에서 수산화 인회석을 가수분해함

○ PerCP

○ Sepharose

○ glucose oxidase 

○ Europium

○ APC

○ agarose  

⑹ 트러블슈팅 

① cross-reactivity

② false-positive : primary antibody를 묽힘으로써 false-positive signal을 줄일 수 있음

⑺ 응용 1. multiplexed immunohistochemistry

① 목적 : 하나의 조직에서 여러 종류의 항원의 분포를 높은 해상도로 얻기 위함

② 1단계. slide prep

③ 2단계. epitope retrieval

④ 3단계. blocking

⑤ 4단계. primary AB incubation

⑥ 5단계. secondary AB incubation (e.g., Opal polymer HRP incubation)

⑦ 6단계. signal amplification

⑧ 7단계. antibody stripping

⑨ 8단계. repeat step 3-7 for each primary AB

 

 

4. 3차원 면역염색법(3D immuno-staining) [목차]

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 3. 3차원 면역염색법 개요^]

 

⑴ 1^st. decellularization

① 1^st - 1^st. 마우스를 안락사시킴

② 1^st - 2^nd. 해부학적으로 특정 기관을 분리

③ 1^st - 3^rd. perfusion fixation

○ 1^st - 3^rd - 1^st. perfusion fixation 기기의 셋팅

출처 : 이미지 클릭

Figure. 4. perfusion fixation 기기의 셋팅^]

 

○ 1^st - 3^rd - 2^nd. perfusion surgery

○ 1^st - 3^rd - 3^rd. perfusion

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 5. perfusion^]

 

④ 1^st - 4^th. 조직 교차결합(tissue cross-linking)

⑤ 1^st - 5^th. 조직 세척(tissue clearing)

⑵ 2^nd. 면역염색법(immuno-staining)

① 2^nd - 1^st. 블로킹(blocking)

② 2^nd - 2^nd. 1차 항체 혼성화(primary antibody hybridization)

③ 2^nd - 3^rd. 2차 항체 혼성화(secondary antibody hybridization)

○ 2차 항체에는 fluorescent dye가 표지돼 있음

○ primary antibody만 있으면 신호가 크지 않음

○ secondary antibody를 씀으로써 신호를 증폭하는 효과가 나타남

⑶ 3^rd. imaging

① 3^rd - 1^st. 영상획득(image acquisition)

○ 3^rd - 1^st - 1^st. 공초점 현미경으로 각 2차원 이미지를 얻음

○ 3^rd - 1^st - 2^nd. z축으로 각 2차원 이미지를 쌓음

② 3^rd - 2^nd. 디콘볼루션(deconvolution) 및 3D 재구성

③ 3^rd - 3^rd. 이미지 분석

 

입력: 2019.02.18 22:22

수정: 2020.02.08 21:58