【생물학】 37강. 생물학 실험

37강. 생물학 실험

 

추천글 : 【생물학】 생물학 목차

---

1. 정량실험 [본문]

2. 세포실험 [본문]

3. 조직실험 [본문]

4. 동물실험 [본문]

5. 임상시험 [본문]

---

a. 약리학(PK/PD)

b. 미생물학 실험

c. 세포배양 프로토콜

d. 생물학 실험에 사용되는 형광물질 종류 

e. 생물학 실험과 관련된 영어 약자

---

 

1. 정량실험 [목차]

⑴ 방법 1. 원심분리(centrifugation)

① 세포분획법

 

출처 : 2019년 7월 고3 이투스 전국연합 모의고사 생명과학II

Figure. 1. 세포분획법^]

A는 핵, B는 엽록체, C는 미토콘드리아

 

○ 1차 원심 분리 (1,000g, 10분) : 핵이 침전함

○ 2차 원심 분리 (3,000g, 10분) : 엽록체가 침전함

○ 3차 원심 분리 (20,000g, 10분) : 미토콘드리아가 침전함

○ 4차 원심 분리 (150,000g, 180분) : 소포체가 침전함

○ 침강계수 S

○ Svedberg unit

○ sucrose gradient에 따른 침강계수

○ 단순 합이 성립하지 않음

② CsCl₂ 밀도차 원심분리 : 등밀도 정지

③ 설탕 농도차 원심분리

○ 원리 : 직접 이동. 분획수가 낮을수록 밀도가 높음

○ 장점 : 실제로 채취도 할 수 있음

⑵ 방법 2. 흡광정량

① 예 1. colorimetric lactate quantification : 젖산 함량 측정

⑶ 방법 3. 형광정량

① 주요 형광물질

○ Alexa series : NHS 부분이 있어 amine과 결합

○ Di series : lipophilic dye

○ FITC : amine과 결합

○ GFP : 자외선이 비춰지면 녹색의 형광을 발하는 단백질

○ SITS : 아민기를 특이적으로 표지하는 형광 물질

○ Syto60 : DNA dye

○ SYTOX : 염색체와 결합하는 초록색 형광물질을 이용하여 죽은 세포의 양을 측정

○ 기타 생물학 실험에 사용되는 형광물질 리스트

② ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)

○ 정의 : 특정 항체와 항원을 감지하고 정량하는 데 사용되는 방법

○ 직접 ELISA : BSA를 깔고 표적물질 - 1차 항체 - 2차 항체와 같은 구조물을 생성시켜 형광을 관찰하는 것 

○ BSA : 해상도를 개선시켜 줌

○ 1차 항체와 2차 항체는 서로 다른 동물 종에서 추출할 것 (∵ 면역반응 감도를 높이기 위함)

○ 간접 ELISA : BSA를 깔고 1차 항체 - 표적 물질 - 2차 항체와 같은 구조물을 생성시켜 형광을 관찰하는 것

○ BSA : 해상도를 개선시켜 줌

○ 1차 항체와 2차 항체는 서로 다른 동물 종에서 추출할 것 (∵ 면역반응 감도를 높이기 위함) 

○ 단점

○ 자동화돼 있지 않으므로 labor-intensive

○ 표적물질마다 서로 다른 항체를 구입해야 하므로 실험이 비쌈

○ 형광에 의존하므로 auto-fluorescence가 있을 수 있음 

③ FRET(Förster/fluorescence resonance energy transfer)

○ 목적 : 두 단백질의 근접성 평가

○ 원리 : 형광 공명에너지 전달 

⑷ 방법 4. 방사선 정량

① 수소 (³H) : 핵산 정량

○ [³H]-dT (데옥시티미딘) : 세포 내 DNA를 방사성 동위원소로 표지하는 데 사용하는 화합물

○ pulse-chase : 일정 시간방사성 표지를 붙였다가 그 이후에는 붙이지 않았을 때 그 차이를 확인하는 방법

○ pulse-labeling : 방사성 표지를 계속 붙여서 확인하는 방법

○ [³H]-UDP : 전사가 일어나는 부위를 타겟팅

② 탄소 (¹⁶C) : 포도당을 추적하여 암을 진단

③ 플루오린 (¹⁸F) : FDG로 PET-CT 검사

④ 인 (³²P) : DNA 추적

○ ATP에 있어서 α-³²P : ATP α 위치에 방사성 동위원소를 붙임

○ 인산이에스테르 결합(DNA와 RNA의 골격)의 인산기 추적

○ 뉴클레오티드 자체의 유무를 확인

○ ATP에 있어서 γ-³²P : ATP γ 위치에 방사성 동위원소를 붙임

○ 신호전달에서의 인산기 추적

○ 중합반응 확인

⑤ 황 (³⁵S) : 단백질 추적

⑥ 테크네슘 (^99mTc) : 핵의학 검사 70% 이상

⑦ 인듐 (¹¹¹In) : 뇌종양 촬영

⑧ 요오드 (¹²³I) : 갑상샘 질환 검사

⑨ 요오드 (¹²⁴I) : PET 이미징

⑩ 요오드 (¹²⁵I) : 체외 검체 검사, 갑상선 치료

⑪ 요오드 (¹³¹I) : 갑상샘 종양 치료

⑫ 탈륨 (²⁰¹Tl) : 심장 질환 검사

⑸ 응용 1. 단백질 함량 분석법

① 목적 : 대사물질의 농도 측정, 수용체 농도 측정, 효소 역가 측정

② Folin-Lowry method

○ 원리 : Folin reagent가 방향족 아미노산인 티로신, 페닐알라닌, 트립토판과 반응

○ alkaline copper를 처리할 때 파란색이 되는 것을 이용하여 흡광도를 측정함

○ 범위 : 20 ~ 400 μg/ml

○ 단점 : 단백질 내에 방향족 아미노산이 비교적 적게 함유될 경우 단백질 양을 과소평가하게 됨

③ Bradford method

○ 원리 : Coomassie Blue G-250이 산성 조건에서 단백질에 부착하면서 흡광도가 변함

○ dye만 있는 경우 465 nm의 흡광도를 띠지만, protein + dye 조건에서 595 nm의 흡광도를 띰

○ 장점 : 방향족 아미노산 함량에 의존하지 않음

○ 단점 : Lowry method보다 5배 정도 더 민감하기 때문에 30분 이내에 흡광도를 측정해야 함

④ Biuret

○ 원리 : Cu2+와 단백질 내 NH 그룹의 결합

○ 범위 : 1 ~ 20 mg/ml

○ 단점 : rough한 방법

⑤ BCA assay

⑥ UV 280 nm spectrometer

○ 원리 : Phe, Trp, Tyr의 페닐기의 흡광도인 280 ㎚를 대표적으로 사용함

○ 단점 : DNA와의 interference가 있을 수 있으며 Lowry method보다 10배 덜 sensitive함

⑹ 응용 2. 핵산 함량 분석법

① Hoechst 33258 method

○ 458 nm에서 hoechst 33258과 DNA와의 상호작용으로 발생하는 형광을 측정

○ 10 ng/ml까지 측정할 수 있지만 intact ds DNA를 이용함

② DAPI(diamidino-2-phenylindole) method

○ 454 nm에서 형광을 측정

○ DNA 부홈의 AT region에 결합

○ apoptosis marker로도 사용 

③ UV 260 nm absorbance

○ 자료 1.

○ ds DNA의 OD가 1.0인 것은 50 μg/ml를 의미

○ ss DNA의 OD가 1.0인 것은 40 μg/ml를 의미

○ 자료 2. 흡광증가현상

○ ds DNA : 1.0으로 두고 다른 핵산의 흡광도를 상대값으로 나타냄

○ ss DNA : 1.37

○ 절편화된 뉴클레오타이드 : 1.5

○ 단백질과의 상호작용 때문에 purified DNA만 이용함

④ ribo green assay

○ 용액 내 RNA의 농도를 정량

⑺ 응용 3. 면역분석법 : 면역침전법, 방사면역분석법, 면역조직화학법, 3차원 면역염색법 등

⑻ 응용 4. 결합측정법(binding assay) : target과 targeting agent 간의 친화도를 보는 측정 방법

① yeast two hybrid assay

② surface plasmon resonance

③ isothermal titration calorimetry

④ gel chromatography

⑤ NMR spectroscopy

⑥ X-ray crystallography

⑦ cryo-EM

⑧ radioligand binding assay 

 

 

2. 세포실험 [목차]

⑴ 현미경

① 광학현미경

② 주사전자현미경(SEM) : 표면구조 관찰

③ 투과전자현미경(TEM) : 내부구조 관찰

④ 주사터널링현미경(STM) : 표면구조 관찰

⑤ 원자힘현미경(AFM)

⑥ 암시야현미경

⑦ 형광 현미경

⑵ 세포배양

① 종류 1. transwell-based model 

○ migration

○ invasion

○ transendothelial migration

② 종류 2. spheroid-based model

○ cell suspension culture

○ non-adherent surface

○ hanging drop technique

○ microfluidic device

③ 종류 3. hybrid model

○ embedded ex vivo tumor section

○ 3D invasion model

○ avascular microfluidic model

④ 종류 4. tumor-microvessel model

○ predefined ECM scaffold

○ microvessel self-assembly

⑶ 세포 카운팅(cell counting) 

① 혈구계수기(헤마사이토미터, hemacytometer)

○ 원래 적혈구 및 백혈구를 카운트할 때 이용하던 방법

○ 헤마사이토미터를 이용한 세포정량 프로토콜

② Coulter counter : electronic particle counting

○ 1^st. 세포가 좁은 구멍을 통해 빨려 들어가면 current flow가 변화함

○ 2^nd. current flow의 변화는 펄스를 생성시킴

○ 3^rd. 그 펄스를 기계가 카운팅하여 세포 수를 계산함

○ 특징 : cell counting뿐만 아니라, cell sizing, 살아있는 세포의 비율 정량, aggregate cell 정량 등도 가능함

③ stained monolayer

○ 세포를 multi-well plate나 terasaki plate에 직접 고정하고 염색시켜 카운팅하는 방법

○ 세포의 숫자가 아주 적을 때 사용할 수 있음

④ cell weight

○ 이 방법은 부정확한 방법으로 세포의 수가 아주 많은 경우에 일부 사용될 때가 있음

○ 예 1. murine leukemia (e.g., L5178Y)

○ 직경 : 11-12 μm. 부피 : 800 μm³

○ cells/g × 10⁶ : 1250 (calculated), 1000 (measured)

○ 예 2. Hela

○ 직경 : 14-16 μm. 부피 : 1200 μm³

○ cells/g × 10⁶ : 800 (calculated), 250 (measured)

○ 예 3. human diploid fibroblast

○ 직경 : 16-18 μm. 부피 : 2500 μm³

○ cells/g × 10⁶ : 400 (calculated), 180 (measured))

⑤ 유세포 분석법(flow cytometry)

○ 항원-항체 반응을 통해 세포가 특정 항원을 가지는를 판별하여 세포 현탁액에서 종류별 세포의 양을 식별함

○ 실험자가 원하는 세포를 분류해주는 기능이 추가된 경우 FACS(fluorescence activated cell sorter)라고 함

⑷ 세포 염색

① 세포독성 실험 : XTT assay, WST assay, XTT assay, CCK-8 assay 등

② Oil Red O 염색 : 지방세포 분화 평가

③ ARS 염색(alizarin red S staining) : 골세포 분화 평가

④ DCF 염색(dichlorofluorescein assay) : ROS 평가

⑤ 니슬 염색(Nissl body) 

○ 조면소포체 리보솜 및 과립세포질망(rough endoplasmic reticulum)이 염색되어 표범무늬처럼 보이는 것

○ 니슬 염색에 사용되는 염색약은 염기성 염색약

⑸ DNA 테크놀로지

① DNA 재조합

② 유전자 도서관

③ PCR(poly chain reaction)

④ DNA 지문법

⑤ 혼성화 : 서던블롯팅, 노던블롯팅, 웨스턴블롯팅, DNA chip (microarray), ISH 등

⑥ 유전자 결손 : 녹아웃 마우스, Cre-Lox, siRNA

⑦ 핵치환 : 핵치환, 형질전환체, 유전자 변형 식품

⑧ DNA-단백질 상호작용 연구 : 유전자 지문법, EMSA, ChIP 등 

⑨ 단백질-단백질 상호작용 연구 : 이중잡종체계, yeast two hybrid 등

⑩ 유전자 치료 : CRISPR/Cas 9 유전자 가위기술, siRNA 치료제, mRNA 약물전달시스템 등

⑹ in vitro 시퀀싱

① 시퀀싱 방법

○ in vitro 클로닝

○ 디데옥시 사슬 종결법

○ dye-디데옥시 사슬 종결법

○ 파이로시퀀싱

○ Illumina solid-phase amplification

② 시퀀싱 응용

○ WGS(whole genome sequencing)

○ WES(whole exome sequencing)

○ ChIP-seq

○ scRNA-seq(single cell RNA sequencing)

○ bisulfite sequencing

○ Hi-C sequencing

○ long read sequencing

○ non-invasive sequencing 

⑺ 미생물학 실험  

 

 

3. 조직실험 [목차]

⑴ 조직 관찰

① H&E staining 

○ 개요

○ H는 염기성 염색약인 헤마톡실린(haematoxylin), E는 산성 염색약인 에오신(eosin)을 의미함

○ 임상 병리에서 환자의 질환이나 치료 방법을 알아내기 위한 표준 방법으로 H&E 염색이 사용됨

○ 1단계 : 고정(fixation) 

○ 일반적으로 10% 중성 완충 포르말린으로 조직의 자가융해나 미생물에 의한 부패를 방지하기 위한 과정

○ 2단계 : 절취(gross section)

○ 조직을 적절한 크기나 형태로 자르는 과정

○ 3단계 : 수세(washing)

○ 4단계 : 조직 처리(processing)

○ 4-1단계 : 탈수(dehydration) : 조직의 수분을 제거하는 과정

○ 4-2단계 : 투명(clearing) : 탈수에 사용된 알코올을 xylene으로 치환하는 과정

○ 4-3단계 : 침투(infiltration) : 조직을 paraffin으로 채우는 과정

○ 5단계 : 포매(embedding)

○ 조직을 박절하기 위해 paraffin block으로 만드는 과정

○ embedding center가 사용됨

○ 6단계 : 박절(sectioning)

○ 세포 형태를 현미경으로 관찰할 수 있는 두께로 자르는 과정

○ microtome이 사용됨

○ 7단계 : H&E 염색 및 봉입(H&E staining & mounting)

○ 박절로 얻어진 조직 절편 슬라이드를 H&E로 염색하고 현미경으로 관찰할 수 있게 cover glass를 덮는 과정

○ 핵 : hematoxylin에 의해 보라색으로 염색됨

○ 세포질 : eosin에 의해 붉은색으로 염색됨

○ 최근에는 autostainer 등 H&E를 자동화하는 기기가 많이 사용되고 있음

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 2. H&E 염색

 

○ 8단계. 조직병리학적 해석 

② 기타 조직 염색법 

○ 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 염색 

○ ALP assay (alkaline phosphatase assay) 

○ ALP는 주로 간과 뼈에서 찾을 수 있는 효소

○ pH 10.5 정도의 알칼리성 환경에서 수산화 인회석을 가수분해함

○ 405 nm의 흡광도로 측정

○ MT 염색(Masson's Trichrome staining)

○ 빨간색 : 세포질, 케라틴, 근섬유, 적혈구

○ 검정색 : 핵

○ 파란색 : 콜라겐, 점액, 교원섬유

○ PAS(Periodic acid-Schiff) staining

○ 보라색 glycogen 성분을 관찰하기 위한 특수염색

○ glycogen 외에도 다른 polysaccharides나 mucosubstance (mucin, glycoprotein 등)을 관찰 가능 

○ Jones' silver stain : basement membrane을 염색

○ Sirius red staining : 빨간색 collagen 성분을 관찰하기 위한 특수염색

○ Alcian blue staining : mucine staining

○ pH map

○ DHE(dihydroethidium) staining : superoxide detection

○ Picrosirius red staining : ECM staining

○ Luxol fast blue : 세포 병리학과 뇌백질의 integrity를 평가할 때 사용

○ Herovici staining : collagen deposit을 염색

⑵ 3차원 영상 획득

① 생체 내 영상(intravital imaging)

○ 실험 과정

 

출처 : 이미지 클릭

 

Figure. 3. intravital imaging 실험과정^]

 

○ (참고) GSL-1-cy3는 혈관벽에 대한 intravital imaging에서 사용함 

② 3차원 면역염색법 

③ 기타 3차원 영상기기 

○ US : 검사 장치에서 발사한 초음파와 혈액에서 반사된 초음파의 진동수 차를 이용하여 건강 상태를 파악하는 것

○ PET : 양전자를 방출하는 동위원소가 전자를 만나 쌍소멸 및 감마선을 방출하는 것을 이용하는 3차원 비침습 영상기기

○ MRI : 핵자기공명을 이용하여 비침습적으로 생체나 샘플의 자기이완율을 보는 것

○ CT : X-ray가 잘 투과할수록 이미지가 검게 변하는데, 이러한 X-ray를 3차원으로 두른 것

○ SPECT : 감마 입자를 방출하는 동위원소를X-ray CT처럼 영상 촬영에 이용하는 것

○ TPEM

⑶ 조직 독성 실험

① 피내 반응

○ 시험물질을 피내에 주사 후 나타나는 국소 자극성을 평가

○ 동물실험의 자극성 테스트를 적용할 수 없을 때 또는 시험물질이 소수성일 때 사용

② 용혈성 시험

○ 적혈구의 용해 정도와 헤모글로빈의 방출을 보기 위한 실험 

○ 1^st. EDTA 함유 진공 채혈관에 혈액 첨가 후 배양

○ 2^nd. 1시간 배양 후 원심분리

○ 3^rd. 상등액을 모아 헤모글로빈의 용출 정도 측정

○ 4^th. 용혈율(%) = (시험액 흡광도 - 공시험액 흡광도) ÷ (양성대조액 흡광도 - 공시험액 흡광도) × 100

③ 혈소판 응집 시험

○ 종류 1. 혈소판 수 측정

○ 종류 2. 혈소판 응집

○ 종류 3. 혈액세포 유착 측정 : 적을수록 혈액적합성 높음

④ 면역학 시험

○ 1^st. 말초혈액 백혈구(PBMC)가 이물질을 만나 염증반응을 일으켜 여러 사이토카인 생산

○ 2^nd. 역전사-중합효소법이나 효소-면역측정법을 통해 생산량 평가

⑤ 혈장 단백질 응고 시험

○ 재료 표면에서의 혈장 단백질의 특성 시험

○ 혈장 단백질 : 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 면역 글로불린 등

○ 혈장 단백질 응고 시험 종류

○ 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT)

○ 프로트롬빈 시간(PT)

○ 트롬빈 시간(TT)

○ 피브리노겐

○ 피브리노겐과 피브린 분해 산물(FDP)

○ 특정 응고 인자 측정법

○ FPA, D-dimer, F₁₊₂, TAT

○ Lee-White 법

○ Imai-Nose 법

⑥ 혈액검사

⑷ in situ 시퀀싱  

① ISS(in situ sequencing) 

② spatial transcriptomics 

 

 

4. 동물실험 [목차]

⑴ 개요 : 전임상실험에 해당

⑵ 동물실험 일반 과정

① 실험동물의 관찰

② 보정, 투여, 채혈

③ 마취법, 안락사, 부검

④ 위해성 테스트

⑤ 종양모델

⑥ 동물실험 관련 법규 : 일반적으로 화장품은 동물실험이 금지돼 있음 

⑶ 리소스

① The Jackson Laboratory (ref1, ref2, ref3) : 동물실험 관련 유용 리소스 제공

⑷ 약리학

① 약물과 약물의 투입에 따른 생체의 반응을 연구하는 생화학

② 약력학(PD)과 약동학(PK)으로 구분 

 

 

5. 임상시험 : 사람 대상. 일반적으로 세포실험 → 동물실험 → 임상실험으로 수행 [목차]

⑴ 개요 

① 약물 개발 단계

○ 약물 탐색 : 3 ~ 5년

○ 전임상 : 1 ~ 2년

○ 임상시험 : 6 ~ 7년 

○ FDA 허가 : 1 ~ 2년

② 매해 약 50 ~ 60개의 신약이 FDA 승인을 받음

③ 점점 비용이 증가하고 실패율은 90%에 상당함

④ 대부분의 실패 요인은 치료 효과가 없다는 것

○ 이를 방지하기 위해 1상에서도 efficacy와 dose finding을 찾으려는 노력을 하고 있음

○ 더 빨리 사람에 투약해서 보기 위해 phase 0 study도 도입되고 있음

○ PET imaging을 이용하는 것도 하나의 전략이 될 수 있음

⑵ 1상 임상실험 : 탐색적 임상시험 

① 20 ~ 80명 수준

② 유형 1. 안정성을 보는 게 목적이라면 건강 자원자를 대상으로 함

③ 유형 2. anti-cancer drug : 암 말기 환자 등 소수의 지원자들에게 시험됨

④ 목적

○ 약동학(parmacokinetics) : ADME에 관한 이론

○ 상호작용(interaction)

○ 안정성(safety) (dose dependent)

○ MTD(maximum tolerated dose), tolerable dose range, 용량-내약성 연구

○ PK / PD 연구

⑤ 방법

○ dose 대 effect 곡선 : NOAEL, NOEL, MED(min effective dose), MABEL

○ single dose rising, multiple dose rising

○ drug-drug interaction

⑶ 2상 임상실험 : 보다 많은 수의 사람들을 대상으로 시험됨. 탐색적 임상시험

① 100 ~ 200명 수준

② 전기 2상 임상시험 (IIa) : 유효성(efficacy) 검사

③ 후기 2상 임상시험 (IIb) : 투약량 탐색(dose finding)

⑷ 3상 임상실험 : 시판 허가를 얻기 위해 마지막 단계의 임상시험. 확증적 임상시험

① 통계적으로 확증하기 위해 대규모 수준(large scale)으로 진행

② 목적 : 안정성(safety)과 치료효과(effectiveness) 확증

③ 일반적으로 시판 승인까지 통상 5 ~ 6년 걸림 (long-term)

⑸ 4상 임상실험 : 신약의 시판 사용 후 장기간의 효능 및 안전성 평가

① 시판 후 조사

 

입력: 2019.11.30 10:43

수정: 2022.11.07 22:51