【생물학】 세포실험 프로토콜 9강. 세포 염색

세포실험 프로토콜 9강. 세포 염색

 

추천글 : 【생물학】 세포배양 프로토콜 목차 

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가. Oil Red O 염색 [본문]

나. ARS 염색 [본문]

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가. Oil Red O 염색(staining) [목차]

Oil Red O 염색은 지방 분자에 흡착하는 Oil Red O -시약의 흡광도를 분석함으로써 상대적인 시약의 양을 알려주는 분석법이다. 실험의 편의를 위해서 T-flask에서 실험을 수행하였으며, 이에 기본 protocol에서 권장하는 시약의 양에 바닥의 면적비인 2.6을 곱하였다.

 

 

Figure 2. 기존 Oil Red O 과정

 

 

 

Figure 3. 개선된 Oil Red O 과정

 

1. 세포를 배양한다.

2. 세포에서 배지를 제거한다.

3. 세포를 세척하기 위해 5.2 ㎖ 정도의 DPBS를 첨가하고 골고루 섞이게 한 뒤 제거한다.

4. 10 % 포르말린 용액 5.2 ㎖를 RT(Room Temperature)에서 첨가하고 10분 동안 방치한다.

5. 포르말린(Formalin)을 제거하고 다시 포르말린 5.2 ㎖를 첨가한다. 그리고 최소 1시간 반 동안 방치한다.

6. 포르말린을 피펫으로 제거한다.

7. ddH₂O 5.2 ㎖로 세척하는 것을 두 차례 시행한다.

8. RT에서 60 % iso-propanol을 5.2 ㎖ 첨가한 후 5분 동안 방치, 그 후 다시 플라스크를 비운다.

9. RT에서 플라스크를 완전히 말린다. 말리는 과정에서 헤어 드라이기를 사용해도 된다.

10. 2.6 ㎖ Oil Red O 작동 용액(Working Solution)을 첨가하고 10분 동안 RT에서 방치한다.

11. Oil red O 용액을 제거하고 즉시 ddH₂O를 5.2 ㎖를 첨가한다.

12. 4번째 세척에선 ddH₂O를 제거하지 않고 현미경으로 관찰한 후 세포가 염색된 것을 확인한다.

13. 플라스크의 물을 버린 뒤 플라스크를 앞서와 같이 말린다.

14. 100 % iso-propanol을 첨가하여 10분 동안 천천히 흔들어서 Oil Red O가 완전히 녹아나오도록 한다.

15. 이를 6 웰 플레이트에 옮기고 6개의 웰 중 한 웰에 같은 양의 100 % iso-propanol로 채워두어 블랭크로 사용하도록 한다.

16. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 630 ㎚에서 또 흡광도를 측정하여 490 ㎚의 흡광도를 보정한다.

⑴ Oil Red O 가 수단 Ⅲ나 Ⅳ보다 더 진하기 때문에 대체되고 있다.

⑵ Oil Red O 분자량 : 408.5 g/mol

⑶ ⅰ. Oil Red O 저장 용액(Stock Solution) : 0.35 g Oil Red O를 100% iso-propanol에 첨가

⑷  ⅱ. Oil Red O 작동 용액(Working Solution) : 6 ㎖ Oil Red O 저장 용액 + 4 ㎖ ddH₂O(3차 증류수)

⑸ ⅲ. 60 % iso-propanol : 6 ㎖ 100% iso-propanol + 4 ㎖ ddH₂O

 

oil red o staining_protocol.pdf

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나. ARS 염색(Alizarin red s staining) [목차]

1. ARS

⑴ 성숙한 골세포 내 칼슘을 염색하여 초기 단계의 기질 석회화를 식별하는 데 사용

⑵ orange-red 색으로 염색하기 때문에 562 nm에서 흡광도를 측정

2. 고정 단계 (12 well 기준)

⑴ 배지 제거

⑵ PBS washing 1-2회

⑶ 4% paraformaldehyde 용액 1 ml씩 처리한 후 15-20분 인큐베이터에 보관

⑷ dw washing 3회

3. 염색 단계 (12 well 기준)

⑴ ARS 1 ml를 첨가한 후 pH를 4.1 ~ 4.3으로 조절 : 1% ammonium hydroxide로 조절

⑵ 30분간 상온에서 인큐베이션

⑶ dw washing 3회

⑷ 촬영

4. 탈염색 단계 (12 well 기준)

⑴ destaining 용액 첨가 (24 well 기준 0.5 ml) : 10% cetylpyridinium chloride / 10 mM sodium phosphate / pH 7.0 

⑵ 15분간 상온에서 인큐베이션

⑶ 96 well에 옮긴 뒤 562 nm에서 흡광도 측정

 

입력: 2013.12.29 03:49

수정: 2021.12.21 12:02