【생물학】 세포실험 프로토콜 8강. 분화 유도

세포실험 프로토콜 8강. 분화 유도

 

추천글 : 【생물학】 세포배양 프로토콜 목차 

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가. 분화 유도 [본문]

나. 지방세포 분화 유도 [본문]

다. 골세포 분화 유도 [본문]

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가. 분화 유도 [목차]

1. 화학적 자극

⑴ 생리적 물질 : 내분비 호르몬, 사이토카인, 비타민, 레티노이드, Ca²⁺, O₂/CO₂ 등 

⑵ 세포막 유동성에 영향을 주는 물질 : DMSO, HMBA, 극성 용매, 마취제, 진정제 등

⑶ 약물 : Methotrexate, hydroxyurea, cytosine arabinosides, mitomycin C, genistein

⑷ 신호전달에 영향을 주는 물질 : PMA(phorbol meristate acetate) 등

2. 세포-세포 상호작용

3. 세포-기질 상호작용

4. 전기적 극성

5. 세포 형태 변화 : filter well insert, M1/M2 macrophage conversion 등

6. 산소 자극 : 저농도의 산소에서 분화가 촉진됨. 2019년 노벨 생리의학상

 

 

나. 지방세포 분화 유도 : 3T3-L1 분화 [목차]

3T3-L1은 분화하여 지방세포가 된다. 3T3-L1을 분화시키는 방법은 다음과 같다.

 

1. T-25 flask에서 배양하던 세포에서 배지를 suction 한다.

2. 혈청의 영향을 제거하기 위해 배지를 suction한 T-25 flask를 DPBS로 1~2회 세척한다.

3. Trypsin-EDTA를 첨가한 후 활성을 위해 CO₂ incubator에서 2분 동안 incubating 한다.

4. 2분 동안 incubating 한 후 T-25 flask를 톡톡 쳐서 세포가 제대로 떨어지도록 한 뒤 conical tube에 옮겨 담고 혈청이 포함된 배지 7 ㎖을 담는다.

5. 1000 rpm에서 210초동안 원심분리를 하고 약 1 ㎖만 남기고 상층액을 제거한다.

6. Pipetting을 통해 세포가 고루 퍼지도록 하고 cell counting 방법으로 세포의 수를 센다.

7. 5만 개/well의 농도로 세포를 6 well-plate의 5개 well에 접종한다.

8. 접종한 well에 DMEM, FBS 10 %, PS 1 %로 만든 배지를 2 ㎖씩 넣고 CO₂ incubator에 배양한다.

9. 4일경에 confluence 된 후 24시간을 더 기다린다.

10. DMEM 배지에 FBS 10 %, PS 1 %, IBMX 0.5 mM, Dex 1 μM과 Insulin 10 μg/㎖을 넣어 분화배지를 만든다. 이 때 처리하고자 하는 시료도 같이 넣어준다.

11. 48시간 후 위의 분화배지를 같은 조성의 DMEM, FBS 10 %, PS 1 %, Insulin 10 μg/㎖만 넣은 Insulin배지로 갈아준다.

12. 바로 이전의 과정을 한 번 더 반복한다.

 

MDI&Insulin Solution.hwp

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다. 골세포 분화 [목차]

1. 분화 배지 : 기본 배지 + 분화 유도 물질

⑴ 아스코르브산 (비타민 C) : 수용성, 항산화 작용, 제1형 콜라겐 분비 촉진

⑵ β-glycerophosphate : 수산화인회석 형성에 필요한 인산을 공급

⑶ 덱사메타손(dexamethasone)

2. 유전자 마커

⑴ BMP(bone morphogenetic protein) : 사이토카인 류의 성장인자. 7종류

⑵ TGF-β(transforming growth factor beta) : G1에서 증식을 정지시켜 분화를 촉진

⑶ Runx2(Runt-related transcription factor 2) : 골 분화 시 주요 전사인자

 

입력: 2020.04.22 18:01