【생물학】 세포실험 프로토콜 6강. 세포독성 실험

세포실험 프로토콜 6강. 세포독성 실험

 

추천글 : 【생물학】 세포배양 프로토콜 목차 

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가. 용출물 희석법 [본문]

가-Ⓐ. MTT assay [본문]

가-Ⓑ. WST assay [본문]

가-Ⓒ. XTT assay [본문]

가-Ⓓ. CCK-8 assay [본문]

나. 직접 접촉법 [본문]

다. 한천 확산법 [본문]

라. 여가지 확산법 [본문]

마. vital dye를 이용한 방법 [본문]

바. 기타 세포독성 실험 [본문]

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가. 용출물 희석법 [목차]

용출물 희석법은 재료로부터 유리되어 나온 물질의 농도에 따른 세포독성 확인방법이다. MTT assay, WST assay, XTT assay, CCK-8 assay 등 여러 가지 종류가 있다.

 

1. 세포 접종

2. 인큐베이션

3. 독성물질 주입

4. 인큐베이션

5. 세포 독성 측정 가능 시약 처리 : MTT, WST, XTT, CCK-8 등

6. 배지 제거 : MTT 시약에만 해당

7. DMSO 처리 : MTT 시약에만 해당

8. 흡광도 측정 

 

 

가-Ⓐ. MTT assay [목차]

MTT assay는 아래에 나타낸 그림과 같으며 각 시료의 처리에 따른 세포의 생존율을 분석하는 과정이다. MTT(3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenul-tetrazolium bromide) 시료를 사용한다.

 

Figure. 1. MTT assay 과정

 

1. 배양된 세포를 웰 플레이트에 분주한다.

2. 습윤, 5% CO₂ 조건에서 인큐베이터 내 보관한다.

⑴ 시간을 24시간으로 정해 놓거나 100% 꽉찼는지(Confluence)를 기준으로 한다.

3. 다양한 농도로 준비된 실험물질을 각 웰에 첨가한다.

4. 인슐린 배지로 교환한다.

5. 실험 조건에 맞게 적절한 시간 동안 인큐베이터에서 반응시킨다. (예: 6, 12, 24, 48시간)

6. 배지를 제거한 뒤 PBS로 세척한다.

⑴ 세척 시 배양 용기를 흔들어 주어야 한다.

7. 다시 배지를 넣고 MTT 용액을 배지의 양의 10%만큼 처리한다.

⑴ 6 웰 플레이트의 경우 200 ㎕를 처리한다.

⑵ 96 웰 플레이트의 경우 20 ㎕를 처리한다.

8. 2시간 정도 인큐베이터에서 반응시킨다.

9. 그 뒤 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 2 ㎖ 처리한다.

10. 반응시킨 웰 플레이트에서 용액의 반 정도를 새 웰 플레이트에 옮긴다.

⑴ 거품은 흡광도에 큰 영향을 주므로 거품이 생기지 않도록 피펫 끝에 약간 남겨둔다.

⑵ 옮기기 전 농도가 골고루 분포하도록 다시 섞어주는 과정(re-suspension)도 중요하다.

11. 3번 정도 부드럽게 흔들어준다.

12. 그 후 ELISA 플레이트 리더(Plate Reader)를 이용하여 490 ㎚, 630 ㎚에서 흡광도를 측정한다.

13. 630 ㎚ 흡광도 값에서 490 ㎚ 흡광도 값을 뺌으로써 흡광도 값을 보정한다. 

⑴ 살아있는 세포는 미토콘드리아의 탈수소 효소에 의해 MTT tetrazolium을 청자색의 MTT formazan으로 환원

⑵ 죽은 세포는 미토콘드리아가 작동하지 못해 노란색 수용성 기질인 MTT tetrazolium만 관찰됨

⑶ MTT tetrazolium : 노란색 수용성 기질

⑷ MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 

① 청자색 불용성 물질 

② 540 nm에서 최대 흡광을 보이므로 굳이 630 ㎚에서 흡광도를 측정할 필요는 없음

14. 비어-램버트 법칙 (Beer-Lambert Law)

⑴ 증명

 

 

① I : 빛의 세기

② d : 빛이 투과하는 경로의 길이

③ a : 매질에 따른 흡광계수

④ T : 투과율

⑤ A : 흡광도 (단위 : OD(optical density))

⑥ c : 몰농도

⑦ ε : 몰 흡광계수

⑵ 결론

① 흡광도는 흡광물질의 농도에 비례 → 세포의 양에 비례

② 흡광물질은 Tetrazolium을 지칭

 

 

가-Ⓑ. WST assay [목차]

WST assay는 좀 더 단순한 과정이다. MTT를 개선한 WST(Water Soluble Tetrazolium)를 사용한다.

 

1. 배양된 세포를 웰 플레이트에 분주한다.

2. 습윤, 5% CO₂ 조건에서 인큐베이터 내 보관한다.

⑴ 시간을 24시간으로 정해 놓거나 100% 꽉찼는지(Confluence)를 기준으로 한다.

3. 다양한 농도로 준비된 실험물질을 각 웰에 첨가한다.

4. 실험 조건에 맞게 적절한 시간 동안 인큐베이터에서 반응시킨다. (예: 6, 12, 24, 48시간)

5. 배지를 제거한 뒤 PBS로 세척한다.

⑴ 세척 시 배양 용기를 흔들어 주어야 한다.

6. 다시 배지를 넣고 WST 용액(ex. EZ-cytox)을 배지의 양의 10%만큼 처리한다.

⑴ 6 웰 플레이트의 경우 200 ㎕를 처리한다.

⑵ 96 웰 플레이트의 경우 20 ㎕를 처리한다.

7. 0.5 ~ 4 시간(대개 1시간) 정도 인큐베이터에서 반응시킨다.

8. 반응시킨 웰 플레이트에서 용액의 반 정도를 새 웰 플레이트에 옮긴다.

⑴ 거품은 흡광도에 큰 영향을 주므로 거품이 생기지 않도록 피펫 끝에 약간 남겨둔다.

⑵ 옮기기 전 농도가 골고루 분포하도록 다시 섞어주는 과정(Re-suspension)도 중요하다.

9. 3번 정도 부드럽게 흔들어 준다.

10. 그 후 ELISA 플레이트 리더(Plate Reader)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정한다.

⑴ 광학 기기라서 미리 1시간 정도 켜 두어야 한다.

⑵ 해당 프로그램에 들어가서 파장 등의 값을 세팅한다.

⑶ 웰을 올려 놓고 프로그램을 작동시킨다.

⑷ 흡광도를 표시한 엑셀 파일을 넘겨 받는다.

 

 

가-Ⓒ. XTT assay [목차]

 

 

가-Ⓓ. CCK-8 assay [목차]

 

 

나. 직접 접촉법  [목차]

1. 충분한 세포층이 형성될 때까지 세포주 플레이팅 

2. 각 웰을 PBS로 세척

3. 웰에 각각 음성대조물질, 양성대조물질, 시험물질을 얹고 신선한 배지를 첨가

⑴ 음성대조물질 : HDPE, 알루미늄 옥사이드 세라믹 등

⑵ 양성대조물질 : PVC, ZDECfilm, 페놀희석액 등

4. 같은 조건에서 24시간 동안 배양 후 PBS 세척

5. 0.2% crystal violet 염색시약으로 염색

6. 물질과 접촉된 주변으로 성장이 억제된 zone의 크기를 측정

7. zone index를 구하여 독성 정도를 평가

 

Zone Index	설명
0	시료 아래 혹은 주변에 zone이 전혀 생기지 않은 경우
1	시료 아래 부분에만 한정되어 zone이 생기는 경우
2	시료로부터 0.5 cm 이내의 구역에 zone이 생기는 경우
3	시료로부터 0.5 cm ~ 1.0 cm의 구역에 zone이 생기는 경우
4	시료로부터 1.0 cm 밖의 구역에 zone이 생겼으나 전체에 zone이 생기지 않은 경우
5	zone이 dish 전체에 걸쳐 생긴 경우

 

Table. 1. zone index 계산

 

 

다. 한천 확산법  [목차]

1. 충분히 세포를 배양하여 세포층을 형성

2. 세포층에 고형의 한천층을 올림

3. 고형의 한천층 위에 세포층의 표면적의 1/10 정도가 되는 음성대조물질, 양성대조물질, 시험물질 배치

4. 24 ~ 72시간 동안 배양

5. 배양이 끝난 후 neutral red를 이용하여 세포층을 염색

6. 염색량을 비교하여 세포독성 평가 

 

 

라. 여과지 확산법  [목차]

1. 계면활성제가 처리되지 않은 0.45 ㎛ 체공의 여과지 위에 세포 배양 

2. 고형의 한천층 위에 여과지를 올려놓음 : 세포가 있는 면이 한천층에 닿도록 함

3. 여과지에서 세포가 없는 면에 음성대조물질, 양성대조물질, 시험물질을 배치하여 2시간 정도 배양

4. 배양 후 시료를 제거하고 여과지를 한천으로부터 분리

5. 여과지 상의 세포에 적절한 염색법으로 염색

6. 염색량을 비교하여 세포독성 평가

 

 

마. vital dye를 이용한 방법  [목차]

1. annexin-V staining : 인지질의 비대칭성이 깨진 세포막의 바깥쪽의 포스파티딜 세린에 대한 staining assay

2. TUNEL assay(terminal transferase dUTP nick-end labeling) : apoptosis로 분해되는 dsDNA를 측정하는 assay

3. γ-H2AX assay : DNA 이중나선 결합의 파괴 여부를 보여주는 assay

4. Calcein-AM assay : live cell이 많으면 신호가 크게 나옴

5. PI(propium assay) : dead cell이 많으면 신호가 크게 나옴

6. Ki-67 assay : Ki-67은 cell proliferation marker로 쓰임

7. DAPI : DNA 부홈의 AT region에 결합. apoptosis marker로도 사용

8. CD8-PD1 : 높을수록 apoptosis가 많이 일어남을 의미

9. caspase 3/7 : apoptosis marker

10. PARP cleavage : apoptosis marker 

11. 8-OHdG (8-hydroxy-2’-deoxyguanosine) : DNA oxidative marker

12. CC3(cleaved caspase 3) staining : apoptosis assay

 

부록 : 생물학 실험에 사용되는 형광물질(dye) 종류

 

 

바. 기타 세포독성 실험 [목차]

1. intracellular protein

⑴ G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase)

⑵ LHD (lactate dehydrogenase)

2. cellular metabolism

⑴ ATP

⑵ MTT

3. model organism

⑴ MMP

⑵ HMGB1

4. 미세세포 독성 실험 

 

입력: 2016.06.23 18:18

수정: 2020.04.22 17:29