【생물학】 BCA assay

BCA assay

 

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1. 개요 [본문]

2. BCA solution 제조 [본문]

3. standard solution 제조 [본문]

4. sample solution 제조 [본문]

5. 반응 진행 [본문]

6. microplate reader [본문]

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1. 개요 [목차]

⑴ BCA protein assay는 Smith, et al.에 의해 1985년에 소개됨

⑵ 현재 가장 많이 사용되고 있음

⑶ 장점 : 단백질 간의 차이가 근소함. sensitivity가 우수함

출처 : 이미지 클릭

Figure. 1. BCA protein assay와 Bradford protein assay의 비교^]

 

⑷ 단점 : 준비시약이 많음. 절차가 복잡함. 다른 환원제, 구리 킬레이터, 고농도의 버퍼에 의해 간섭을 받을 수 있음

① 환원제의 예 : DTT, β-ME

② 구리 킬레이터의 예 : EDTA, EGTA

⑸ 뷰렛 반응(biuret reaction), Lowry method, Peterson method 등 변형된 프로토콜이 있음

 

 

2. BCA solution 제조 [목차]

⑴ 1-1. BCA reagent A 2 ㎖를 15 ㎖ conical tube에 넣기

① BCA reagent A = BCA reagent + carbonate buffer

⑵ 1-2. BCA reagent B 40 ㎕를 1-1의 15 ㎖ conical tube에 넣기

① BCA reagent B = cupric sulfate solution

 

 

3. standard solution 제조 [목차]

⑴ standard solution은 흡광도로부터 농도를 결정할 수 있는 비례계수를 알려줌

⑵ 2-1. 96 well plate에 dw를 각각 10 ㎕, 9 ㎕, 8 ㎕, 7 ㎕, 6 ㎕, 5 ㎕ 넣기

① serial dilution을 할 때 일반적으로 dw를 넣음

⑶ 2-2. 2-1의 96 well plate에 BSA를 각각 0 ㎕, 1 ㎕, 2 ㎕, 3 ㎕, 4 ㎕, 5 ㎕ 넣기

① 각 well 내 총 solution 부피가 10 ㎕가 되도록 함

② dw를 먼저 넣는 이유 : 양이 많고 싸기 때문

⑷ 2-3. 2-2의 96 well plate에 BCA solution을 200 ㎕를 넣음

① 일반적으로 20배의 BCA solution을 첨가함

 

 

4. sample solution 제조 [목차]

⑴ 3-1. 96 well plate에 각 샘플을 10 ㎕ 넣기

⑵ 3-2. 96 well plate에 BCA solution을 200 ㎕를 넣음

① 일반적으로 20배의 BCA solution을 첨가함

 

 

5. 반응 진행 [목차]

⑴ 호일로 well plate를 감싼 뒤 37 ℃에서 30분간 incubation을 함

⑵ 단계 1. Cu²⁺ → Cu⁺

① 주로 시스테인(cysteine), 시스틴(cystine), 티로신(tyrosine), tryptophan에 의해 환원됨

② Bradford method와 달리 peptide backbone도 환원반응에 관여하기 때문에 단백질 간 차이가 적어짐

⑶ 단계 2. Cu⁺와 착물을 reagent가 착물을 형성하여 색깔이 변함

① apple green의 Cu²⁺에서 보라색의 Cu⁺-BCA complex가 형성됨

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 2. Cu⁺의 착물형성 반응^]

 

 

6. microplate reader [목차]

⑴ 5-1. PC 실행. microplate reader 실행. 패스워드는 "microplate"

⑵ 5-2. Gen5 실행

⑶ 5-3. 절차를 계속하다가 흡광파장 설정 시 562 nm를 입력함

⑷ 5-4. A1이라고 쓰여진 부분에 맞게 well plate를 배치한 뒤 흡광도 분석을 실시함

 

입력: 2020.02.12 15:30