【생물학】 9-1강. 핵산(DNA, RNA) 추출 및 정제 실험

9-1강. 핵산(DNA, RNA) 추출 및 정제 실험

 

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1. 사람 DNA 추출 실험 [본문]

2. 동물세포의 DNA 추출 실험 [본문]

3. 식물세포의 DNA 추출 실험 [본문]

4. 박테리아에서 플라스미드 DNA를 분리하는 실험 [본문]

5. RNA 추출 실험 [본문]

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1. 사람 DNA 추출 실험 [목차]

⑴ DNA를 분리하고자 하는 샘플을 준비

① 보통 혈액이나 머리카락, 입 속의 피부 세포를 이용

⑵ 핵 속의 DNA를 추출하기 위해 세포막 및 핵막을 터뜨려 DNA를 방출시킴

⑶ 효소를 이용하여 DNA를 분해를 방지

⑷ 단백질 분해 효소 15 μl를 준비하여 마이크로 튜브에 담고 샘플 500 μl를 넣음

⑸ 단백질이 분해될 수 있도록 56 ℃에서 반응시킨 후 단백질 제거 용액(P.C.I) 500 μl를 넣은 후 잘 섞어줌

⑹ 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액만을 새로운 튜브에 옮김

⑺ 튜브에 1 ml의 100% 에탄올을 넣고 얼음에 꽂아 넣어 DNA를 침전시킴

⑻ 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액만을 조심스럽게 버림

⑼ 증류수를 첨가하여 DNA를 혼합한 후 DNA 혼탁액을 아가로즈 젤에 옮김

⑽ 아가로즈 젤에 DNA 혼탁액을 넣고 음극에서 양극으로 전기장을 걸어줌

⑾ 시간이 지난 후 분자 질량에 따라 분리된 전기영동 결과를 자외선 투영기 혹은 형광 결과로 확인

 

 

2. 동물세포의 DNA 추출 실험 [목차]

⑴ PBS 용액으로 세포를 씻어줌

① 동물세포 배양액이나 기타 다른 완충 용

⑴ PBS 용액으로 세포를 씻어줌 

① 동물세포 배양액이나 기타 다른 완충 용액을 제거하는 과정

⑵ STE 용액으로 세포를 현탁

① 추후에 실험할 과정에서 사용되는 완충용액 

⑶ 20 % SDS 용액을 첨가

① 세포막을 녹여줌

⑷ proteinase K를 첨가한 후 4시간 반응시킴

① 세포 내 단백질들을 분해시킴

⑸ 원심분리 

① 상층액을 다음 단계에서 이용

⑹ phenol 첨가 후 혼합

① 세포에서 단백질을 녹여내는 과정

⑺ 원심분리

① 원심분리 후 3개의 층이 보이는데 맨 아래부터 페놀층, 단백질층, 상층액으로 나눠짐

② DNA는 상층액에 들어있음

⑻ 차가운 95 % 에탄올과 sodium acetate을 첨가 후 혼합

① DNA를 침전시키기 위한 조건이다. 

② DNA 함유된 용액에 이 물질들을 첨가하면 DNA는 실타래처럼 엉기게 됨

⑼ 원심분리

① DNA는 침전됨

⑽ 침전물을 70 % 에탄올로 첨가 후 혼합

① DNA를 세척하는 과정

⑾ 원심분리

⑿ 침전물을 적당한 부피의 완충용액에 녹임

 

 

3. 식물세포의 DNA 추출 실험 [목차]

 

 

4. 박테리아에서 플라스미드 DNA를 분리하는 실험 [목차]

⑴ 박테리아 수확

⑵ 50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0 용액을 첨가한 후 현탁

⑶ 0.2 N NaOH, 1.0% SDS 용액을 첨가한 후 혼합

⑷ 3 M potassium acetate, pH 4.8 용액을 첨가한 후 혼합

⑸ 원심분리

⑹ 이소프로판올을 첨가한 후 혼합

⑺ 원심분리

⑻ 침전물을 70% 에탄올로 세척

⑼ 침전물을 적당한 부피의 완충용액에 녹임

 

 

5. RNA 추출 실험 [목차]

⑴ 배경지식 

① RNA는 DNA에 비해 가수분해되기 쉬움 

② 체내에는 RNA를 파괴하는 RNAase라는 효소도 존재

⑵ 1^st. RNA로부터 RNA를 보호

① DEPC(diethylpyrocarbonate)라는 리보핵산가수분해효소(RNase) 저해제를 사용

② 참고로 DEPC는 단백질의 아미노기, 이미다졸기를 에톡시포르밀화하기 위해 단백질의 화학수식 시약으로도 사용

⑶ 2^nd. 단백질을 제거

① 방법 1. phenol / chloroform을 처리 : 단백질 및 RNase를 변성시킴

② 방법 2. ultracentrifuge 등을 이용

⑷ 3^rd. RNA로부터 선택적으로 RNA를 분리 

① 방법 1. 염석(salting-out)

② 방법 2. 여러 차례의 centrifuge 혹은 ultracentrifuge

 

입력: 2019.03.06 20:13

수정: 2020.02.08 12:54