【논문】 The entry of nanoparticles into solid tumours

The entry of nanoparticles into solid tumours^[각주:3]

 

Shrey Sindhwani, et al. Nature Matrials, 2020.

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1. Background

⑴ nanoparticle의 pathway

① passive pathway : nano particle이 inter-endothelial gap과 transcellular channel을 통해 들어가는 것

○ inter-endothelial gap (Fig.1-a) : 최대 2,000 nm

○ transcellular channel (Fig. 1-a)

② active pathway : trans-endothelial pathway라고도 함

○ fenestrae 

○ vacuoles 

⑵ method 

① 동물실험

 

Figure. 1. 사용한 마우스의 수

 

① ICP-MS(inductively coupled plasma-mass spectroscopy)

② TEM analysis

○ 특징

○ 장점 : 해상도가 높음

○ 단점 : 정적임

 

Figure. 2. TEM analysis

 

○ 1^st. CD-1 nude 마우스에 U87-MG glioblastoma를 접종 

○ U87-MG 이외에도 각각 4T1, MMTV-PyMT, PDX를 접종함

○ 2^nd. 3주간 방치

○ 3^rd. Fixation

○ 4^th. 종양 적출

○ 5^th. Ultramicrotome을 통해 90 nm slice들로 쪼갬

○ 6^th. TEM 관찰

③ 3D immuno-staining

 

Figure. 3. 3D immuno-staining^[각주:1]

 

○ Anti-VE-cadherin antibody : Tight junction과 반응

○ Anti-PV-1 antibody : Vesicle, Fenestrae와 반응

○ GSL-1-cy3 : 혈관벽을 염색

④ Dark-field microscopy 

○ AuNP가 초록색 빛으로 보임

 

 

2. lemma 1. NP가 tumor로 들어가는 데 있어서 passive pathway는 dominant하지 않다

⑴ lemma 1-1. 종양 내 축적되는 nanoparticle의 양의 실제값 결정

① ICP-MS(inductively coupled plasma-mass spectrometry) 

② 결과 : 0.63 %ID/g tumor의 결과가 나옴

○ 초기 injected dose : 2 × 10¹² nanoparticles / g tumor

○ 1 g의 tumor 당 1.3 × 10¹⁰ nanoparticles가 발견됨 

○ 계산

 

 

⑵ 용액 내 용질의 물질전달은 대류에 의한 물질전달과 농도에 의한 물질전달로 나타남

⑶ lemma 1-2. 대류에 의한 물질전달에 의해 종양 내에 축적되는 nanoparticle의 양은 많지 않음

① TEM 분석

○ 장점 : 광학현미경이 광학한계 때문에 gap을 관찰할 수 없는 한계를 보완함 

○ 단점 : 부분을 통해 전체를 추론

○ (추정) 표면적의 계산 : 둘레 × 높이(= 90 nm)

○ 결과 1. 혈관의 전체 표면적 : 2,171 ㎛². MATLAB으로 계산

○ 결과 2. gaps의 전체 표면적 : 1.03 ㎛². MATLAB으로 계산

○ 혈관의 전체 표면적의 0.048%

○ gaps는 총 26개가 발견

○ 결과 3. 예상 gaps의 밀도 : 500 gaps / ㎜² 

○ 가정 : gap 하나의 면적은 1 ㎛²라고 가정. 원으로 가정하고 πr²을 계산한 듯

○ 계산

 

 

○ 결과 4. 암 1 g에 대한 결과로 확장

○ 조직의 단위부피 당 혈관의 표면적 : 0.0034 ㎛^-1 

○ 암 1g에 대한 혈관의 전체 표면적은 3.4 × 10⁹ ㎛² 

 

 

○ 암 1g에 대한 gaps의 전체 표면적은 1.7 × 10⁶ ㎛² 

 

 

○ 암 1g에 대한 gaps의 전체 개수는 1.7 × 10⁶개 

 

 

② 3D microscopy + VE-cadherin antibody staining

○ tight junction(≒ gaps)도 적었다 (Fig. 1-c)

○ TEM 관찰 결과를 보완함 

③ bi-exponential decay model 

○ (참고) 초기 injected dose : 2 × 10¹² nanoparticles / g tumor

○ (참고) 1 g의 tumor 당 1.3 × 10¹⁰ nanoparticles가 발견됨 

○ (참고) 1 g의 tumor 당 gap의 전체 개수는 1.7 × 10⁶개 

○ 1개의 gap마다 7,650개의 nanoparticle을 통과시킴

 

 

○ 혈액 내에서 nanoparticle의 decay를 분석한 결과 다음과 같은 감소함수를 보임

 

 

○ cell uptake가 적으므로 n(t)의 식에서 nanoparticle의 물질전달에 의한 감소는 무시

○ 1.1 particles / ㎛³의 의미 

○ (참고) mouse의 혈액 부피 : 58.5 ㎖ / kg bodyweight

○ (참고) 25 g의 mouse의 혈액의 부피 : 1.46 ㎖. 이 논문에서는 1.8 ㎖로 계산했다는 언급이 있음

○ 초기 injected dose : 2 × 10¹² nanoparticles / g tumor

○ t = 0일 때 모든 nanoparticle은 혈액 내에 있음

 

 

④ Q의 계산 : 혈액에서 tumor로 꾸준한 유량 Q가 흐른다고 가정

 

 

⑤ 실제 Q의 값 

○ 전체 유량 = 0.1 ~ 0.4 mm³/hr

○ Q = 전체 유량 ÷ gap의 수

 

 

○ 해석 : 실제 축적된 양 0.63 % ID/g tumor를 설명하려면 실제보다 훨씬 많은 유량을 필요로 함

⑷ lemma 1-3. 농도에 의한 물질전달에 의해 종양 내에 축적되는 nanoparticle의 양은 많지 않음

① TED 분석 결과 1 ~ 결과 3을 준용

② 확산계수 D의 결정^[각주:2]

○ 1^st. Fluo-EX labeling kit : 형광물질인 FITC와 conjugation

○ 2^nd. Krypton-argon laser : FRAP 현상을 통해 분자들이 형광 빛을 발하도록 함

○ 3^rd. CCD 카메라로 녹화한 뒤 Spatial Fourier analysis technique으로 위치좌표를 특정

○ 4^th. Exponential time decay를 계산하여 확산계수 D를 결정

③ 컴퓨터 시뮬레이션

○ mathematical model

 

 

○ R : source term 또는 sink term

○ R이 source term으로 작용하여 nanoparticle이 생성되는 경우는 있음

○ R이 sink term으로 작용하여 nanoparticle이 소멸되는 경우는 bi-exponential decay model을 이용한 걸로 추정

○ blood vessel networks mapped from 3D images of tumours + varying numbers of gaps + mathematical model

○ 결과 : 0.0158 %ID/g 

⑷ 결론

○ accumulation은 이론이 실제보다 1/40배

○ gap number는 이론이 실제보다 1/60배

 

 

3. lemma 2. NP는 active pathway를 통해 들어갈 수 있다

⑴ lemma 2-1. fenestrae, vacuoles가 gaps보다 훨씬 많다

① 얼마나 많은지

⑵ lemma 2-2. 정말로 nanoparticles가 fenestrae와 vacuoles를 타고 이동한다.

① 정말로 nanoparticles가 fenestrae와 vacuoles를 타고 이동하는 모습 (Fig. 2-b) 

② 15 min circulation과 60 min circulation을 비교한 모습

○ 세 사람이 57,080개의 nanoparticles를 셈 : 평균 낸 듯

○ 표 제시하기 (Supplementary Table 5)

 

 

4. lemma 3. NP가 tumor로 들어가는 데 있어서 active pathway가 dominant하다

⑴ 좀비 모델

① 발상 

○ 좀비 모델에서 passive pathway는 작동함 (∵ gap의 형태는 유지되기 때문)

○ 좀비 모델에서 active pathway는 작동하지 않음 (∵ 세포가 죽어 있기 때문)

② 만드는 법

○ schema

○ supplementary video 1

⑵ lemma 3-1. validation of Zombie model (1) : passive pathway가 동일할 것이라는 확증

① 증거 1. 새로운 gaps가 생성되지 않음 (Fig. 3c, 3d )

② 증거 2. kidney gap은 6.5 nm 정도로 여전히 유지됨 (Fig. 3e)

③ 증거 3. liver sinusoidal endothelial cell의 gpa은 여전히 열려 있음 (Fig. 3f)

④ 증거 4. continuous vessel이 있는 조직은 여전히 continuous함 (Fig. 3d)

⑤ 증거 5. circulatory system은 여전히 잘 보존됨 (Fig. 4e)

⑶ lemma 3-2. validation of Zombie model (2) : active pathway가 없을 것이라는 확증

① 증거 1. nanoparticle의 vesicle을 통한 extravasation은 관찰되지 않음

② 증거 2. cellular uptake가 관찰되지 않음

③ 증거 3. glutaraldehyde fixation

⑷ lemma 3-3. ICP-MS quantification (Fig. 4-a, 4-b)

① 좀비 모델은 clearance system이 없기 때문에 blood의 데이터를 통해 보정을 해주어야 함

② 모델을 MMTV-PyMT로 바꾸어줘도 비슷한 결과를 보임

③ 적혈구를 포함하여 혈관에 흘려주어도 비슷한 결과를 보임

④ 왜 Fig. 4-b와 같은 size dependency를 보이는지는 추가적은 연구를 필요로 함

⑸ lemma 3-4. TEM analysis : Control (Fig. 4-c) vs Zombie (Fig. 4-d)

① 49% AuNP가 extravasation을 함

② 0% AuNP가 extravasation을 함

⑹ lemma 3-5. intravital imaging + dark-field microscopy

① Control (Fig. 4-e)은 퍼져 있는데 Zombie (Fig. 4-g)는 뭉쳐 있음

 

 

5. lemma 4. gaps are also rare in tumour vessels from cancer patients. 

⑴ lemma 4-1. endothelial lining을 따라서 tight junction과 fenestrae의 분포가 쥐와 유사함

⑵ lemma 4-2. blood vessel discontinuity가 mouse와 같이 관찰되므로 gaps가 충분히 있지 않을 것이다.

 

 

6. discussion

⑴ 후속 과제 1. nanoparticle이 solid tumour로 들어가는 분자생물학적 경로 탐색

⑵ 후속 과제 2. tumour endothelial cell surface protein과 nanoparticle의 상호작용 (Fig. 5-c, 5-d)

① 가설 : nanoparticle 표면에 알부민이 부착되고, 알부민을 인식하여 transcytosis가 일어남

○ transcytosis에 caveolin이 관여함

○ 알부민을 코팅한 nanoparticle이 caveolin이 관여하는 transcytosis를 거친다는 선행 논문이 있음

② 결과 : caveolin knock-out mouse에서도 transcytosis가 일어남

③ 해석 : nanoparticle 표면에 붙은 다른 단백질이 transcytosis를 일으킴 

⑶ 후속 과제 3. trans-endothelial transport를 활성화하는 방법 (예 : antibody transport)

⑷ 후속 과제 4. nanoparticle의 크기, tumour의 종류에 따른 차이 이해하기

⑸ 후속 과제 5. 면역세포의 역할을 이해하기

 

입력: 2020.01.21 21:51

 

1. 출처 : Alejandro et al., Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D, Nature Protocol, 2019. [본문으로]
2. Saroja Ramanujan, et al., Diffusion and Convection in Collagen Gels: Implications for Transport in the Tumor Interstitium, Biophysical Journal Volume 83, September (2002) [본문으로]
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