Li, F., Liang, Z., Liu, J., Sun, J., Hu, X., Zhao, M., ... & Hyeon, T. (2019). Dynamically reversible iron oxide nanoparticle assemblies for targeted amplification of T1-weighted magnetic resonance imaging of tumors. Nano letters, 19(7), 4213-4220.1
1. 개요
⑴ 용어
① IONA : pH-sensitive iron oxide nanoparticle assemblies
② ESION : extremly small-sized iron oxide nanoparticle
③ PIONA : pH-sensitive polymer-assisted iron oxide nanoparticle assemblies
⑵ design of IONA (Fig. 1 (a))
⑶ schematic illustration of pH-triggered nonlinearity amplified MR signal using IONA (Fig. 2 (f))
⑷ shcematic illustration of MR imaging using IONAs (Fig. 3 (a), 4 (a))
⑸ schematic illustration of the structural changes of IONAs, Ins-IONAs, and PIONAs (Fig. 4 (b))
2. 제법
⑴ 리간드 A1의 제법
① terephthaldehyde mono(diethylacetal)로부터 2단계 반응 후 4-(bromomethyl)-benzaldehyde를 합성2
② 4-(bromomethyl)-benzaldehyde 435 mg과 2,4,6-tri(4-pyridyl)-1,3,5-triazine 100 mg을 20 mL의 dry N,N-dimethylformamide (DMF)에 섞고 80 ℃에서 2일 동안 교반
③ 상온으로 식히고 용액을 물에 담그고 CH2Cl2로 washing
④ ammonium hexafluorophosphate (NH4PF6) 1 g을 첨가 : 하얀색 침전물을 형성
⑤ 물을 첨가하여 A13+·3PF6-를 형성
⑥ tetrabutylammonium chloride (TBA·Cl, 0.5 g)를 A13+·3PF6- 100g을 포함하는 acetonitrile solution에 추가함
⑦ 노란색 침전물을 acetonitrile로 washing하고 A13+·3Cl-를 생성시킴
⑵ ESION의 제법 : oleic acid-coated ESION이라고도 함
① 1.8 g iron-oleate complex, 0.57 g oleic acid, 1.61 g oleyl alcohol을 10 g의 diphenyl ether에 상온 조건에서 혼합
② 10 ℃ / min의 비율로 250 ℃로 가열
③ 아르곤 기체 하에서 30분간 250 ℃를 유지함
④ 즉시 혼합물을 제거하여 상온으로 식힘
⑤ 40 mL의 아세톤을 첨가하고 11000 rpm 하에서 10분간 centrifuge
⑥ 침전물을 10 mL의 chloroform에 녹임
⑶ hydrazine-functionalized ESION의 제법
① ESION 50 mg을 15 mL의 1,2-dichlorobenzene - DMF 혼합물 (1:1, v/v)에 녹임
② 100 mg의 citric acid를 혼합물에 용해시키고 100 ℃ 하에서 24시간 동안 교반
③ ethyl ether를 첨가하여 나노입자를 침전시킴
④ 10 mL의 물을 첨가하여 citric acid-coated ESION을 생성시킴
⑤ 3.5 mL의 hydrazine hydrate (85%)를 20 mg citric acid-coated ESION, 50 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), 25 mg N-hydroxysuccinimide (NHS)를 포함하는 2-(4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer (0.1 M, pH = 5.0) 20 mL에 넣고 상온에서 24시간 동안 교반
⑷ IONA의 제법 : (주석) IONA가 제법이 쉽고 퍼포먼스가 뛰어난 듯
① 20 mg의 A1를 10 mL의 물에 녹인 뒤 5 mL의 hydrazine-functionalized ESION (1 mg/mL of Fe)와 혼합
② 50 μL의 trifluoroacetic acid (TFA)를 첨가하고 70 ℃ 하에서 8시간 동안 교반
③ dialysis와 ultrafiltration을 거쳐서 IONA stock solution을 생성
④ A1의 질량비를 1:100에서 60:1로 달리 하여 서로 다른 IONA를 테스트 함
⑸ PIONA의 제법 : (주석) PIONA의 제법은 보지 않아도 될 듯
① 3 g의 β-benzyl-1-aspartate N-carboxy anhydride (BLA-NCA)를 20 mL DMF + 50 mL CH2Cl2에 녹임
② 그 혼합물을 40 ℃ 하에서 α-methoxy-ω-amino-poly(ethylene glycol) (MW = 2000 Da, 240 mg)와 반응시켜 고분자 중합 반응을 진행시킴
③ 48시간이 경과하면 CH2Cl2를 제거하고 ethyl ether를 첨가하여 PEG-PBLA를 침전시킴
④ centrifuge를 거쳐서 수집한 200 mg의 PEG-PBLA를 5 mL의 DMF에 용해시킴
⑤ 1 g의 1-(3-aminopropyl) imidazole (API)를 첨가하여 상온에서 overnight로 반응시킴
⑥ 반응 결과물을 dropwise로 cooled aqueous solution of 0.1 M HCl (20 mL)에 첨가함
⑦ MWCO = 3500 Da로 투석시킴
⑧ 최종 용액을 동결건조하여 pH-sensitive polymer PEG-PBLA-API를 얻음
⑨ 20 mg의 as-synthesized PEG-PBLA-API를 0.6 mL의 methanol에 용해시킴
⑩ 그 뒤 Pluronic F127 20 mg과 ESION 2.5 mg in 3 mL of CHCl3를 혼합함
⑪ 30분간 교반 후 감압 50 mL round-bottom flask의 벽에 필름 형태로 건조
⑫ 4 mL의 물을 플라스크에 투입하여 필름을 수화시킴
⑬ 5분간 ultrasonication 한 후에 15000 rpm 조건에서 15분간 centrifugation하여 정제함
⑭ 물로 두 번 헹구어 과량의 F127과 다른 물질을 제거함
⑹ pH-insensitive iron oxide nanoparticle assemblies (Ins-IONA)의 제법
① 0.5 g의 2-bromo-2-methylpropionic acid (BMPA)와 50 mg의 citric acid를 15 ml의 chlorofom + DMF (1:1, v/v) 혼합물에 녹임
② 15 mg의 ESION을 그 용액에 넣고 상온에서 overnight로 교반
③ centrifugation으로 synthesized BMPA-coated ESION을 수집
④ 이를 10 mL의 DMF에 녹임
⑤ hydrazine hydrate (85%) 2 mL와 BMPA-coated ESION solution (1 mg [Fe]/mL)를 혼합
⑥ 12시간 교반 후 혼합물을 MWCO = 3500 Da로 투석
⑦ ultrafiltration을 거치면 Ins-IONA stock solution이 됨
3. 물성 분석
⑴ TEM analysis and DLS measurement
① TEM image and DLS measurement data of citric acid-coated ESION (Fig. S1)
② TEM image and DLS measurement data of hydrazine-functionalized ESION (Fig. S2)
③ TEM image and DLS measurement data of Ins-IONA (Fig. S10 (b), (c))
④ TEM image and DLS measurement data of PIONA (Fig. S15 (b), (c))
⑤ 물, FBS, DMEM에서 IONA의 DLS particle size (Fig. S11)
⑥ 시간에 따른 IONA의 cumulative Fe release (Fig. S12)
⑦ 시간에 따른 IONA의 DLS particle size (Fig. S13)
⑧ DLS measurement datd of dispersed ESIONs and disassembled PIONAs (Fig. S24)
⑵ FT-IR spectra
① ESION, hydrazine-functionalized ESION, IONA에 대하여 (Fig. S5)
② isolated ESION과 disassembled PIONA에 대하여 (Fig. S21)
⑶ 1H NMR analysis : A1에 대하여 (Fig. S3 (b))
⑷ XRD patterns : ESION, hydrazine-functionalized ESION, IONA에 대하여 (Fig. S4)
⑸ fluorescence method : CAC(critical aggregation concentration)를 결정하는 데 사용
① log C에 대한 fluorescence intensity 그래프 : IONA, PIONA (Fig. S14 (a), (b))
② IONA는 CAC가 관찰되지 않아 false information에 대한 우려가 없음
③ PIONA는 CAC가 관찰되므로 false information에 대한 우려가 있음
⑹ TGA(thermalgravimetric analysis) : dispersed ESION과 disassembled PIONA에 대한 TGA (Fig. S22)
⑺ HRTEM images of dispersed ESIONs and disassembled PIONAs (Fig. S23)
4. 퍼포먼스
⑴ log mass ratio A1 : ESION에 따른 particle size (Fig. S6)
⑵ pH response
① 0.1 N HCl을 첨가하여 7.4에서 5.4까지 pH를 총 8단계로 바꿈
○ pH = 7.4와 5.4에서의 TEM 이미지 (Fig. 1 (c), (d))
○ pH에 따른 DLS particle size (Fig. S7 (a))
○ pH에 따른 ζ 포텐셜 (Fig. S7 (b))
② 0.5 mM [Fe]에 대하여 0.1 N HCl 또는 NaOH를 첨가하여 pH 5.5 ↔ pH 7.4를 여러 번 바꿈
○ cycle에 따른 DLS particle size (Fig. S8 (a))
○ cycle에 따른 ζ 포텐셜 (Fig. S8 (b))
③ pH에 따른 Ins-IONA의 DLS particle size (Fig. S10 (d)) : 두드러진 변화 없음
④ pH에 따른 PIONA의 DLS particle size (Fig. S16) : IONA와 마찬가지로 pH-sensitive함
⑶ fluorescence kinetic study
① RITC-labeled IONA pH 7.4, RITC-labeled IONA pH 5.5, RITC pH 7.4, RITC pH 5.5를 조사함
② RITC-labeld IONA pH 7.4는 assembly가 일어나서 혼자만 다른 신호가 나타남 (Fig. 1 (e), Fig. S9)
③ disassembly time은 13.2초, half disassembly time은 4.5초로 분석됨
⑷ MR signal
① MRI property of IONA
○ 농도에 따른 T1 and T2 weighted image (Fig. 2 (a), (b))
○ r1, r2 value of IONA (Fig. 2 (c), (d))
○ pH 7.4 : r1 = 3.2 mM-1s-1. r2 = 108.0 mM-1s-1. r2 / r1 = 34.2. (T2 agent) (∵ magnetic inhomogeneity)
○ pH 5.5 : r1 = 5.1 mM-1s-1. r2 = 21.3 mM-1s-1. r2 / r1 = 4.1. (T1 agent)
○ 시간에 따른 T1 MR 신호의 추이 (Fig. S17 (b))
○ 6 assembly/disassembly cycles of IONAs as measured by MRI
○ T1-weighted image, T2-weighted image, T1 mapping, T2 mapping (Fig. 2 (e))
○ longitudinal relaxation time (Fig. S18 (a))
○ transverse relaxation time (Fig. S18 (b))
○ T1-weighted MR intensity (Fig. S18 (c))
○ T2-weighted MR intensity (Fig. S18 (d))
② MRI property of Ins-IONA
○ 농도에 따른 T1 and T2 weighted image (Fig. S19 (a), (b))
○ r1, r2 value of Ins-IONA : T2 contrast agent처럼 결과가 나옴 (Fig. S19)
③ MRI property of PIONA
○ 농도에 따른 T1 and T2 weighted image (Fig. S20 (a), (b))
○ r1, r2 value of PIONA : T2 contrast agent처럼 결과가 나옴 (Fig. S20)
5. In vitro study
⑴ viability of L02 cell (human hepatocyte cell line) : IONAs, A1, hydrazine-functionalized ESION에 대해 (Fig. S26)
⑵ confocal microscopy with RITC of A549 cells (Fig. 3 (b))
① IONA를 처리했는지 여부가 lysosome의 수에 영향을 주지 않음 : 세포 사멸(apoptosis)이 없음
② 시간에 따라 RITC 신호가 비선형적으로 증가하여 적극적인 cell의 uptake가 있었다고 볼 수 있음
⑶ ICP-MS를 이용한 A549 cell의 uptake 분석 (Fig. S27) : IONA를 Ins-IONA보다 더 많이 uptake함
⑷ 시간에 따른 fluoresce images of the pellets of A549 : IONA를 Ins-IONA보다 더 많이 uptake함
6. In vivo study
⑴ tissue distribution of Fe before and after i.v. injection of IONA, Ins-IONA, PIONA into A549 tumor-bearing mice (Fig. S30)
⑵ T1-weighted MR images : IONA, Ins-IONA, PIONA 중에서 IONA만 i.v. injection 후 60분 경과 시 특이적인 신호 (Fig. 4 (d))
⑶ T1-weighted MR signal intensity : IONA가 가장 큼 (Fig. S31)
① IONA는 T1MR 신호를 증가시킴; Ins-IONA와 PIONA는 그러지 못함
② IONA의 qss가 뛰어나기 때문 : 즉, IONA에 물 분자가 접근하기 쉬움
⑷ T2-weighted MR images : IONA가 가장 작음 (Fig. S32)
① 일반적으로 T1과 T2는 경향성이 정반대
⑸ T2-weighted MR signal intensity : PIONA가 가장 큼. IONA가 두 번째라 좀 이상함 (Fig. S33)
⑹ blood half-lives of IONAs, Ins-IONAs, and PIONAs (Fig. S34)
⑺ H&E staining : IONA의 생체적합성은 우수함
① H&E staining of tissues obtained 24 h after IONA injection (Fig. S35)
② H&E staining of tissues obtained 15 days after IONA injection (Fig. S36)
⑻ evaluation of liver and kidney functions by biochemical analysis
① serum samples obtained 24 h after IONA injection (Fig. S37)
② serum samples obtained 15 days after IONA injection (Fig. S38)
입력: 2020.07.07 15:41
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