【논문】 Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticle for T2‑Weighted Magnetic Resonance Imaging

Wang, Yaling, et al. "Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticle for T 2-Weighted Magnetic Resonance Imaging." ACS applied materials & interfaces 9.34 (2017): 28959-28966.^[각주:1]

---

 

1. uBSPIO의 제법

⑴ 재료

① Ferrous Salts (FeCl₂·4H₂O) : Sigma-Aldrich

② Ferric Salts (FeCl₃·6H₂O) : Sigma-Aldrich

③ BSA : Sigma-Aldrich

④ Sodium Hydroxide (NaOH) : Sigma-Aldrich

⑤ LHRH Peptide (Pyroglutamic acid-HWSYGLRPG-AHx) : Wu Han Moon Biosciences Co, Ltd

⑵ 제법

① 1^st. 당량비가 1 : 2가 되도록 Fe³⁺와 Fe²⁺를 섞은 Iron Salt Mixture Aqueous Solution 0.8 mL를 준비 

○ 농도는 세부 실험에 따라 달리 설정함

○ MR phantom study : Fe = 0.024, 0.048, 0.074, 0.097, 0.121, 0.146, 0.170, 0.195 (mM)

○ cytotoxic test : Fe = 0, 10, 25, 50, 100, 300, 600 (μg/ml) 

② 2^nd. BSA 20 mg/mL 10 mL와 Iron Salt Mixture Aqueous Solution을 37 ℃ Stirring 하에서 혼합 

○ BSA는 음전하가 많고, 공동이 많아서 Fe₃O₄를 담을 수 있음 

③ 3^rd. 1 M NaOH 1 mL를 첨가함

○ pH가 12 이상이 되도록 함

○ OH^-가 FeCl₂ 또는 FeCl₃를 공격하여 Cl^-를 이탈시키는 듯

④ 4^th. 37 ℃ Water Bath에서 4시간 대기

⑤ 5^th. Dialysis Tube (MWCO: 30 kDa, 500-4000 μL, Midi D-tube, Merck)를 사용하여 BSA와 다른 이온을 제거

⑥ 여기서부터는 in vivo 실험에 특유한 절차

⑦ 6^th. 29.41 mg LHRH를 1 mL MES Buffer Solution (pH 6)에 용해

⑧ 7^th. EDC 4.35 mg과 NHS 2.61 mg을 LHRH MES 용액에 첨가

⑨ 8^th. 45분간 실온, 차광 조건에서 반응시킴 

⑩ 9^th. uBSPIO 5.9 mL를 활성화된 LHRH 용액에 첨가 후 3.5 시간 대기

○ pH는 빠르게 7.5로 조절됨 

⑪ 10^th. Dialysis Tube를 사용하여 순도를 높임 

 

 

2. uBSPIO의 물성

⑴ 색깔 : Dark Brown

⑵ XRD Analysis (Powder X-ray Diffraction Analysis) 

① Inverse Spinel Fe₃O₄에 대한 JCPDS File No. 19-0629와 같음

② Scherrer Formula에 따르면 평균 결정 직경은 ~4.5 nm로 계산됨 (⑷-②와 같은 결과) 

⑶ XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy) 

① 711.1 eV와 724.3 eV는 Fe³⁺의 존재를 암시함

② ~718 eV 피크의 부존재는 Fe₃O₄의 형성을 암시함

⑷ TEM Micrograph 

① 거의 대부분의  uBSPIO가 단분산돼 있고 Aggregation이 관찰되지 않음

② 100개의 입자를 조사해 본 결과 4.78 ± 0.55 nm의 분포를 보임 (⑵-②와 같은 결과)

⑸ Hydrodynamic Diameter 

① ~5.4 ± 0.93 nm (98%)

⑹ HRTEM (High-resolution Transmission Electron Microscopy)

① uBSPIO의 Crystalline Nature를 보여줌 

② 격자 간격

○ 4.85 Å : XRD의 [111] 격자면의 간격과 일치

○ 2.97 Å : XRD의 [220] 격자면의 간격과 일치

○ 2.51 Å, 2.55 Å : XRD의 [311] 격자면의 간격과 일치

⑺ 결론 : 작은 크기, 좋은 단분산성, Single-phase Cubic Inverse Spinel 성질은 조영제로서 좋은 특징을 보여줌

 

 

3. uBSPIO의 퍼포먼스

⑴ Hysteresis Loop

① uBSPIO를 동결건조 시킨 뒤 측정

② 루프의 내부 면적은 0 → 상자성을 의미함

③ 포화 자화는 M_S = 84.32 emu/g으로 기존에 보고된 것보다 훨씬 큼

⑵ T₁-weighted Image와 T₂-weighted Image

① [Fe] = 0.024, 0.048, 0.074, 0.097, 0.121, 0.146, 0.170, 0.195 mM에 대해 실험을 수행

② [Fe] 농도가 높아질수록 T₂-weighted Image는 어두워짐 (예상한 대로)

③ [Fe] 농도가 높아질수록 T₁-weighted Image는 밝아짐 (예상한 대로)

⑶ Longitudinal Relaxation Rate (1/T₁)와 Transverse Relaxation Rate (1/T₂)

① [Fe] = 0.024, 0.048, 0.074, 0.097, 0.121, 0.146, 0.170, 0.195 mM에 대해 실험을 수행

② Longitudinal Relaxivity는 작고 (0.93 ± 0.04 mM^-1s^-1) Transverse Relaxivity는 큼 (444.56 ± 8.82 mM^-1s^-1)

③ r₂/r₁ Ratio는 478 정도로 얻어짐

 

 

4. uBSPIO의 in vitro 실험

⑴ uBSPIO의 안정성 테스트

① 시간에 따른 파장-흡광도 그래프 : 10% FBS 용액을 사용. 안정적

② pH에 따른 육안검사 : PBS 버퍼를 사용. 침전물은 발견되지 않음

③ pH에 따른 파장-흡광도 그래프 : PBS 버퍼를 사용. 안정적

④ pH에 따른 제타 포텐셜 그래프 : PBS 버퍼를 사용. 안정적

⑵ uBSPIO의 안전성 테스트 : LHRH-uBSPIO의 Cytotoxic Effect를 측정함

① Live and Dead Stained Fluorescence Image : 대부분의 세포는 여전히 생존함

② CCK-8 Viability Assay : Fe 농도가 600 μg/mL에 도달할 때 오직 A549 세포의 6%만이 사멸함 

③ Red Blood Cell Hemolysis Test : Fe 농도가 600 μg/mL에 도달할 때 Hemolysis가 거의 발견되지 않음 → 혈액적합성 우수

 

 

5. uBSPIO의 in vivo 실험

⑴ 꼬리정맥을 통해 LHRH-uBSPIO를 주입함

⑵ T₂-weighted MRI

① 암 세포에 들어가는 LHRH-uBSPIO를 추적함 

② MRI 이미지를 통해 Signal Loss Percentage를 측정함 

⑶ Prussian Blue Staining

① Fe 입자들이 종양 내부에서 관찰됨 : 대부분 혈관 근처에 위치

② Mass Aggregation은 없음

⑷ H&E Staining : uBSPIO, LHRH-uBSPIO를 처리한 조직은 정상 조직과 크게 차이 나지 않음

 

입력 : 2020.04.15 23:05

 

1. ⓒ Rights and Permissions : 텍스트 인용 사실 없음, 이미지 인용 사실 없음 [본문으로]