Jung, K. O., Kim, T. J., Yu, J. H., Rhee, S., Zhao, W., Ha, B., ... & Pratx, G. (2020). Whole-body tracking of single cells via positron emission tomography. Nature biomedical engineering, 4(8), 835-844.1
1. 서론
⑴ intravital microscopy
① 장점 : single-cell process를 할 수 있음
② 단점 : whole body에 대해서는 할 수 없음. deep tissue에 대해서 할 수 없음
⑵ photoacoustic effect
① superficial vasculature에 있는 single red blood cell을 visualize할 수 있음
⑶ MRI
① uniform-background anatomical site에서만 할 수 있음
⑷ engineered bioluminescence reporter enzyme
2. 결과 1. characterization
⑴ MSN을 Sigma-Aldrich에서 구입
① 원래부터 propylamine-functionalized MSN
⑵ MSN 표면에 68Ga를 배위결합시킴 : MSN 표면에 Si-O-가 있어서 가능
① 68Ga : 반감기 67분
② MSN(mesoporous silica nanoparticle)는 표면적이 커서 radionuclide를 운반할 수 있음
③ single cell을 인식하려면 나노입자가 꽤 많은 radionuclide를 운반할 수 있어야 함
④ 0.5 Bq / nanoparticle
⑶ lipid coating of MSN
① cell loading을 높이기 위해 68Ga-labelled MSN과 liposome-based trasfection reagent를 결합시킴
② 이때 cationic liposome transfection agent (Lipofectamine)를 사용
⑷ fluorescent dye labeling
① FITC labeling : MSN 표면에 -NH2가 있으므로 thio-urea bond를 형성
② DiO 또는 DiI는 fluorescent lipophilic tracer이므로 그냥 붙여도 되는 듯
3. 결과 2. in vitro study
⑴ cell uptake
① MDA-MB-231 + 68Ga-labelled MSN
② cell들을 25 MBq/ml 68Ga-labelled MSN과 함께 배양
③ 결과 : localization of radioactivity (Fig. 2g, supplemetary Fig. 3a)
④ 흥미롭게도 모든 cell이 동일하게 uptake하는 것은 아님
⑵ radiotracer efflux
① 2h이 지나면 free 68Ga이 50%에 달함
⑶ cell viability assay
① radiation damage를 repair 하느라 일시적으로 metabolic activity가 떨어진 것으로 보임
⑷ WST-8 assay (Fig. 2h)
⑸ γH2AX assay (supplemetary Fig. 6) : DNA damage를 측정
⑹ annexin-V (apoptosis) staining (supplementary Fig. 7)
⑺ Ki-67 staining (supplementary Fig. 8) : radiolabelling이 cell proliferation을 방해하지 않음
⑻ wound healing assay (supplementary Fig. 9) : radiolabelling이 cell migration을 방해하지 않음
⑼ 이러한 결론은 4T1, Raw 264.7 등에서도 보여짐 (supplementary Fig. 10)
4. 결과 3. PET performance
⑴ 72-well Terasaki plate에서 1, 2, 5, 10 cell이 담겨 있음을 형광 이미징으로 확인한 뒤 PET으로 찍어봄
① 평균적으로 30 Bq/cell인 듯
② 0-110 Bq/cell 등 좀 차이가 있음
⑵ water phantom
① 반감기가 지나서 68Ga 신호가 더 이상 나타나지 않기 시작
② CellGPS는 28 Bq가 최솟값인 듯
5. 결과 4. in vivo study
⑴ 100개의 MDA-MB-231 cell을 68Ga-MNS와 DiO를 달고 i.v. injection을 함
① PET-CT : MDA-MB-231이 metastatic breast adenocarcinoma에서 온 거라 다 폐로 간 듯 (Fig. 3a)
○ 원래 폐로 가지 않나?
② Ex vivo gamma counting (supplementary Fig. 14b) : 폐로 간다는 2번째 증거
③ fluorescence microscopy of DiO-labelled cancer cell (supplementary Fig. 14c, d) : 3번째 증거
④ Ex vivo fluorescece imaging : 4번째 증거
⑵ 다른 injection route
① right thigh, intra-peritoneally into the abdomen
② signal이 injection site에 제한돼 있음
⑶ verification
① Terasaki palte에서 묽혀서 radio-activity가 높은 single cell 하나만을 얻음
○ 이 screening process가 꽤 중요함
② PET signal의 직경이 대략 1.7 mm인데 이는 Inveon PET-CT scanner의 공간적 해상도와 비슷함
③ Ex vivo localization of chopping pieces (supplementary Fig. 16)
④ ③에서 추가로 엄청 얇게 잘라서 single speck을 확인
○ red fluorescence
○ Hoechst 33342 & DiI fluorescence
6. 결과 5. CellGPS
⑴ 68Ga 대신 89Zr로 진행
① 68Ga 처럼 chelator-free method로 89Zr를 labeling함
② 89Zr이 13d 이상 있으면 세포에 상당히 분명한 세포 독성이 나타남 (supplementary Fig. 17e)
⑵ algorithm
① raw data로서 list-mode data를 얻음
② 2D-OSEM으로 하는 경우
○ list-mode data를 sinogram으로 변형
○ 그 뒤 2D-OSEM 등의 알고리즘을 사용
○ 한계 1. 실질적으로 dynamic tracking을 할 수 없음
○ 한계 2. 기존의 방식은 V/A ＜ 0.1 mm/s / Bq여야 해서 방사능이 세야 됨
③ cubic B-spline으로 하는 경우
○ list-mode data를 MATLAB에 import
○ cubic B-spline 알고리즘을 사용2
④ (참고) PEPT로 하는 경우
○ single cell을 수십 MBq로 radio-labeling 해야 하는데 그게 쉽지 않음
⑶ 3D printing tube로 verification
① cell들이 벽에 부딪혀서 느려짐
② estimated position이 0.4 mm r.m.s.d.이라 scanner의 spatial resolution이 더 좋음
⑷ mouse injection
① cell 속도가 대략 40 mm/s : 이는 MRI 연구에서 혈류 속도가 40 mm/s였던 선행논문과 결과가 일치함
7. 결론 및 한계
⑴ 89Zr이 독성이 세서 conclusion에서 두 가지 해법을 제안
① 높은 해상도의 PET가 있다면 89Zr을 덜 로딩하면 되긴 함
② radio-protectant를 도입
⑵ 사람만한 scanner에서는 background noise가 꽤 커서 low-noise bismuth-germanate detector 같은 걸 도입해야 함
⑶ 18F-fluoride labeling yeast cell 선행연구가 있어서 nanoparticle로 안 해도 되긴 함
⑷ cancer cell metastasis를 연구할 수 있음
⑸ imuune-cell mobilization을 조사하여 비침습적 진단에도 활용할 수 있음
입력: 2021.01.31 00:34
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