【분자생물학】 2010년 제47회 변리사 2차 국가자격시험

2010년 제47회 변리사 2차 국가자격시험

 

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a. 중심학설

b. DNA 테크놀로지 

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문제 1. 세포에서 DNA 복제를 진행하는 DNA 중합효소는 진행성(processivity)이 매우 낮다. DNA 중합효소의 낮은 진행성은 활주 DNA 클램프(sliding DNA clamp) 단백질과 결합함으로써 1,000배 이상 향상된다. 활주 클램프 단백질의 구조는 생물체에 따라 다소 차이는 있지만 공통적으로 중앙에 통로가 있는 닫힌 원형 구조, 즉 도넛과 같은 형태를 가지며 이중나선 부위에 결합하고 있다.

 

⑴ 1-1. DNA 중합효소의 진행성을 정의하고, 활주 클램프 단백질이 어떻게 DNA 중합효소의 진행성을 높이는지 설명하시오.

 

○ DNA 중합효소의 진행성 : 일반적으로 초당 몇 nucleotide가 합성되는지로 정의되고, DNA 중합에 주로 관여하는 DNA pol III는 1,000 nt/s 정도로 알려져 있다. DNA pol III는 실제로 자기가 DNA 상에서 움직이는 게 아니라 자기는 가만히 있고 DNA 가닥이 움직이는 것이다.

○ 활주 클램프 단백질은 모가닥과 딸가닥이 잘 나열되도록 하여 DNA 중합효소가 실패 없이 DNA를 잘 합성하도록 한다. (즉, DNA 복제의 정확성, 효율성을 증대시킴)

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 1. 활주 클램프 단백질

 

⑵ 1-2. 활주 클램프는 어떻게 닫힌 원형 구조(closed circular form)의 대장균 DNA를 중앙통로에 넣을 수 있는지 설명하시오.

 

○ 활주 클램프는 클램프 로더에 의해 일시적으로 개방되어 닫힌 원형 구조의 대장균 DNA를 중앙통로에 삽입할 수 있으며, 이후 다시 닫혀 DNA 복제 과정에서 중합효소의 활동을 가능하게 한다.

○ 참고로, 진핵생물의 활주 클램프는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)가 관여한다.

 

 

문제 2. microRNA(miRNA)의 정의 및 생성기전을 기술하고, miRNA의 생물학적 기능과 이를 수행하는 기전을 설명하시오.

 

⑴ miRNA의 정의 

○ 핵과 세포질을 거쳐 가공된 작은 단일가닥 RNA

 

⑵ miRNA의 생성기전

○ 1단계. gene → pri-miRNA : RNA pol Ⅱ가 관여

○ 2단계. pri-miRNA → pre-miRNA : Drosha, Dgcr8, Pasha가 관여. pre-miRNA는 헤어핀 구조

○ 3단계. pre-miRNA가 핵외로 방출 : RNA-GTP, Exportin-5가 관여

○ 4단계. pre-miRNA → miRNA/miRNA* duplex : Dicer가 관여. miRNA/miRNA는 dsRNA

○ miRNA/miRNA* duplex는 20 bp 정도 

○ 5단계. miRNA/miRNA* duplex → mature miRNA : Ago, RISC가 관여. miRNA는 ssRNA

○ Ago(Argonaute) 

○ RISC(RNA-induced silencing complex)  

○ 6단계. mature miRNA가 mRNA와 결합 : Ago가 관여 

 

⑶ miRNA의 생물학적 기능과 이를 수행하는 기전

○ 생물학적 기능 : 특정 RNA의 전사를 억제한다. 사람에게 약 250 종류의 miRNA가 존재한다고 한다.

○ miRNA가 mRNA와 완전 상보적인 경우 : mRNA 분해

○ miRNA가 mRNA와 부분 상보적인 경우 : mRNA 번역 중지

 

 

문제 3. Bt 살충 단백질을 암호화하고 있는 박테리아 Bacillus thuringiensis의 야생형(wild type) 유전자 Cry를 이용하여 곤충에 저항성을 갖는 형질전환체 목화를 제조하였다. 형질전환 목화 잎에서 Cry 유전자의 발현을 높이기 위하여 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S promoter를 이용하였고, 목화에 삽입시킨 Cry 유전자 copy 수도 적절하게 조정하였다. 하지만 실제로 목화에서 합성된 Bt 살충 단백질은 소량이었다. 이를 극복하기 위하여 Cry 유전자 내부의 일부 염기서열을 변화시켜 형질전환에 사용하였으며, 그 결과 야생형 유전자를 사용한 경우에 비해서 100배 이상의 단백질이 목화에서 합성되었다. 이에 대한 분자생물학적 기작이 무엇인지 설명하시오. (단, 원인 기작을 유전자 내부의 염기서열 변화로 국한하고 프로모터나 그 외 요인은 관여하지 않는 것으로 가정하시오.)

 

⑴ 코돈 최적화(codon optimization) : 실제로 핵산 치료제에서 가장 중요하게 작용하는 것으로, 동일한 아미노산을 암호화 하더라도 덜 모호하며 (cf. 워블 가설), 더 자주 사용되는 코돈을 이용하면 번역이 빨라질 수 있다. 또한, 동일한 아미노산을 암호화 하더라도 여러 종류의 코돈이 있는 경우보다 단일 종류의 코돈이 있는 경우에 더 번역이 빨라질 수 있다.

⑵ 진핵생물 번역기구에 필요한 염기서열 추가 : 5'-cap과 3'-tail을 넣어야 진핵세포의 번역기구를 사용할 수 있다. 이는 첫 시도에서 실제 목화의 생산량이 소량이었던 점을 반영한다. 또한, 효율성을 증대시키는 engineered cap, tail이 활발히 개발되고 있는데, 다음은 IVT(in vitro transcription)를 위한 인위적인 5'-cap의 예시이다. 

○ 1세대 : mCap (Cap 0). yeast에서 유래. 방향성이 없다는 단점

○ 2세대 : ARCA(anti-reverse cap analog) (Cap 0 mimic). yeast에서 유래. 메틸기를 도입하여 방향성 부여

○ 3세대 : trinucleotide cap analog (eg: CleanCap) (Cap 1). 생체 내 5'-cap과 가장 유사하여 우수함

⑶ mRNA 안정성 증가 : mRNA 안정성을 증대시키기 위해 염기서열을 개선하는 방법도 가능하다.

⑷ RNA 2차구조 개선 : 최근 RNA의 structural biology 연구도 활발히 진행되고 있다. 만약 RNA 염기서열로 인해 RNA의 구조적 복잡성이 크게 증가하면 번역 효율은 많이 감소할 것이다.

 

 

문제 4. 성공적인 유전자치료를 위해서는 치료용 유전자의 발굴과 더불어 유전자를 얼마나 특이적이며 효율적으로 대상 인체 내로 전달할 수 있는가도 매우 중요하다. 유전자 전달체로는 바이러스를 이용한 경우와 비바이러스성 또는 물리적 방법을 이용하는 경우 등으로 나눌 수 있다. 바이러스를 이용하는 경우 유전자 전달을 위해 어떠한 바이러스를 이용하고 있는지를 열거하고 그 장단점도 함께 기술하시오.

 

⑴ 바이러스를 이용한 경우 

○ 형질도입(transduction) : 박테리오 파지가 한 숙주 세균으로부터 다른 숙주 세균으로 유전자를 옮기는 과정을 지칭한다. 일반적으로 독성 파지, 특수한 경우에 온건성 파지를 사용한다.

○ 장점 1. 다양한 염기서열을 가지는 핵산을 전달하여 다양한 유전자를 전달할 수 있다. 이를 응용하여, 약물 개발에 활용한 파지 디스플레이라는 기술은 노벨상을 받기도 했다.

○ 장점 2. 비바이러스성 방법에 비해 박테리아가 아니라 진핵세포에서도 적용할 수 있다.

○ 단점 1. 박테리아가 CRISPR-Cas9과 같은 항 바이러스 체계를 갖춘 경우, 형질 도입이 어려워질 수 있다.

○ 단점 2. 바이러스 배양 조건이 비교적 어려운 편이다.

 

⑵ 비바이러스를 이용한 경우 

○ 형질전환(transformation) : 외부 환경으로부터 다른 세균 개체의 DNA를 받아들여 세균의 유전형과 표현형이 변하는 과정

○ 접합(conjugation) : 일시적으로 인접해 있는 두 개의 박테리아 사이에서 유전물질이 직접 전달되는 현상 

 

⑶ 물리적 방법을 이용한 경우

○ 형질전환(transformation) : CaCl₂ 형질변환 등

○ 형질도입(transduction) : 파지 등 바이러스를 통해 세포주에 DNA를 주입하는 방법

○ 형질 주입(transfection) : 직접 DNA를 세포주에 주입시키는 방법

○ 접합(conjugation)

○ 전기천공법(electroporation) 

○ 미세주입법(microinjection)

○ 유전자 총(particle gun)

 

출처 : Wikipedia

Figure. 2. 유전자 총으로 유전자 삽입

 

입력: 2021.05.29 16:32