【생물학】 9-2강. 웨스턴블롯팅 프로토콜

9-2강. 웨스턴블롯팅 프로토콜

 

추천글 : 【생물학】 9강. DNA 테크놀로지 

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1. gelation [본문]

2. sample running [본문]

3. sample preparation [본문]

4. primary antibody 부착 및 저장 [본문]

5. secondary antibody 부착 [본문]

6. 전기영동 [본문]

7. 단백질 로딩 양을 조절하여 최적의 실험조건을 탐색 [본문]

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1. gelation [목차]

⑴ 1-1. gelation에 쓰이는 한 쌍의 슬라이드 글래스에 있는 얼룩을 알코올 + 킴테크로 지우기

⑵ 1-2. 그 슬라이드 글래스 쌍을 형틀에 끼운 뒤 고정

① 두 슬라이드 글래스 모두 형틀 한쪽면과 바닥면이 닿도록 한 뒤 고정해야 함

○ 이유 : 이후의 과정에서 젤이 굳기 전에 용액이 흘러나오는 것을 방지하기 위함

② 한 슬라이드 글래스는 앞뒤와 위아래가 있음

⑶ 1-3. gelation 장치 위에 스펀지를 올려놓고 물을 뿌린 뒤 1-2에서 작업한 형틀을 올려놓음

⑷ 1-4. 물을 슬라이드 글래스 사이의 틈을 통해 넣고 20분간 기다림

① 물이 새어 나오면 슬라이드 글래스를 제대로 고정하지 않은 것임

② 이후의 과정에서 젤이 굳기 전에 용액이 흘러나오는 것을 방지하기 위함

⑸ 1-5. stacking gel solution과 running gel solution을 제조 : APS 및 TEMED 첨가 직전까지 수행

⑹ 1-6. 기다린 뒤 gelation 장치를 싱크대에 들고 간 후 장치를 거꾸로 뒤집어 물을 제거함

⑺ 1-7. gelation 장치를 한쪽으로 기울여 슬라이드 글래스 사이에 있는 잔존 수분을 제거함

① 제거할 때 킴테크를 사용하여 물을 닦아주는 게 좋음

⑻ 1-8. stacking gel solution에 APS 및 TEMED를 첨가한 뒤 슬라이드 글래스 사이의 틈을 통해 넣음

⑼ 1-9. 이소프로판올 1 ㎖를 첨가함으로써 거품을 제거하고 stacking gel을 더 평탄하게 만들 수 있음 

⑽ 1-10. stacking gel solution의 gelation을 위해 기다림

① stacking gel solution을 약간 더 많이 만듦으로써 넣고 나서 남은 solution의 gelation을 통해 슬라이드 글래스 내 solution의 gelation을 추측할 수 있음

② gelation은 발열반응이므로 gel이 약간 따뜻한 것을 알 수 있음

⑾ 1-11. gelation이 끝난 후 싱크대에 이소프로판올을 제거하고 증류수로 4-5회 세척함

⑿ 1-12. running gel solution에 APS 및 TEMED를 첨가한 뒤 슬라이드 글래스 사이의 틈을 통해 넣음

⒀ 1-13. 즉시 comb를 끼워줌

① comb를 45° 기울인 뒤 쭉 running gel의 표면을 밀고 들어간 뒤 벽에 닿으면 천천히 comb의 반대쪽을 잠기게 함

② 한 번 잠기게 한 comb를 절대로 다시 꺼내면 안 됨

⒁ 1-14. running gel solution의 gelation이 끝난 뒤 comb를 뺌

⒂ 1-15. gel을 소시지처럼 보고 킴테크로 샌드위치처럼 감싼 뒤 락앤락 박스에 놓고 물을 채워 넣음. 냉장 보관

 

 

2. sample running : 프로틴을 젤 상에 running시키는 과정 [목차]

⑴ 2-1. BCA assay를 통해 각 샘플별로 total protein을 정량

⑵ 2-2. 그 중 일정한 protein 양만큼 젤에 로딩함 

⑶ 2-3. 전기영동

 

 

3. sample preparation [목차]

⑴ 프로틴을 PVDF membrane에 부착시키는 과정

⑵ PVDF membrane과 nitrocellulose membrane

① PVDF membrane 

○ 장점 : protein binding degree가 좋음

○ 단점 : 노이즈가 많음. activation 과정이 필요함

② nitrocellulose membrane 

○ 장점 : 노이즈가 적음

○ 단점 : protein binding degree가 나쁨

③ 일반적으로 PVDF membrane가 자주 사용됨

⑶ 3-1. protein sample을 buffer에 용해시킨 뒤 PVDF membrane에 부착시킴

① 용도에 따라 리파 버퍼, 로딩 버퍼, 트랜스퍼 버퍼를 이용

② 리파 버퍼(ripa buffer) : 등장액. 세포를 용해시킬 때 사용하는 버퍼

③ 로딩 버퍼(loading buffer) : 이황화결합을 파괴하는 버퍼. Laemmil sample buffer라고도 함

④ 트랜스퍼 버퍼(transfer buffer) : gel에서 membrane으로 transfer하는 데 사용하는 버퍼

⑷ 3-2. Ponceau staining

① 프로틴이 정말로 membrane에 부착했는지를 확인하는 과정

② 아세트산이 포함된 용액을 씀 

 

 

4. primary antibody 부착 및 저장 [목차]

⑴ 4-1. primary antibody를 부착시킴

⑵ 4-2. primary antibody가 부착된 프로틴을 저장

① BSA나 skim milk에 저장 

② 이때 TBST로 dilution을 함

 

 

5. secondary antibody 부착 [목차]

⑴ 2차 항체를 쓰는 이유

① 혼성화에 참가하는 항체의 수를 늘려 신호를 증폭하기 때문 

 

 

	direct method	indirect method	combined method
정의	2차 항체를 쓰지 않음	2차 항체를 씀	두 방법을 혼합
장점	빠름. 단일 단계 여러 항체 사용 가능	이차 항체의 신호증폭 한 이차 항체가 여러 일차 항체에 결합 가능	이차 항체의 신호 증폭 여러 항체 사용 가능
단점	신호가 미미함	2단계 반응 다른 숙주의 항체 필요	다중 단계 반응

Figure. 1. 2차 항체를 쓰는 이유

 

② 2차 항체의 요건 : 조직의 종과 1차 항체의 유래종은 2차 항체의 유래종과 다른 종이어야 함

③ 2차 항체의 선택

○ 일반적으로 특정 종의 항체의 구조는 공통적이기 때문에 2차 항체는 값이 저렴한 IgG에 대한 항체를 사용함

○ 2차 항체는 항체의 Fc 부분을 타겟팅하는 것과 Fab 부분을 타겟팅하는 게 있음

○ 구조가 비교적 일정한 Fc 부분을 타겟팅하는 2차 항체를 많이 사용함

⑵ 5-1. secondary antibody를 1 : 5000으로 첨가

⑶ 5-2. TBST로 세 번 씻어야 함

① 씻는 과정에서 transfer buffer는 재활용이 가능함

 

 

6. 전기영동 [목차]

⑴ 6-1. 50 V 1시간

⑵ 6-2. 100 V 1시간 

 

 

7. 단백질 로딩 양을 조절하여 최적의 실험조건을 탐색 [목차]

⑴ antibody에 따라 다른 듯

⑵ 일반적인 기준 ^]

① 세포 용해물(cell lysate), 세포막 용해물(membrane lysate), 핵 용해물(nuclear lysate) : 20 ~ 30 μg/well을 로딩

② 정제된 단백질 : 10 ~ 100 ng/well을 로딩

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 2. 최적의 단백질 로드를 찾는 과정^]

 

입력 : 2020.02.19 11:42

수정 : 2022.02.08 15:41