【분자생물학】 2014년 제51회 변리사 2차 국가자격시험

2014년 제51회 변리사 2차 국가자격시험

 

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a. 중심학설

b. DNA 테크놀로지 

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문제 1. 식물에 아그로박테리아(Agrobacterium tumefaciens)가 감염되면 근두암종이 형성된다. 식물분자생물학자는 이 박테리아를 이용하여 형질전환 식물을 만들 수 있다. 다음 물음에 답하시오.

 

⑴ 1-1. Ti-플라스미드에 관하여 설명하고, 아그로박테리아가 식물에서 근두암종을 일으키는 기작을 설명하시오.

 

○ Ti-플라스미드는 근두암종균의 플라스미드를 말하고 T-DNA를 포함한다. T-DNA에는 오파인과 옥신, 시토키닌이 포함돼 있다. 오파인은 근두암종균의 영양분을 제공하고 옥신과 시토키닌은 근두암종이라는 비대한 종양조직을 형성하게 된다. 정리하면 근두암종균이 식물을 감염시키면 vir라는 25 bp의 DNA가 T-DNA 양단을 잘라 식물 핵 염색체에 무작위적으로 T-DNA를 삽입하여 근두암종이 형성되게 된다.

 

⑵ 1-2. 아그로박테리아를 이용하여 제초제에 저항성을 나타내는 담배식물을 만드는 과정을 기술하시오.

 

○ 우선 제초제 저항성을 나타내는 표적 DNA를 T-DNA 영역에 삽입한다. 그 뒤 식물에 상처를 내고 재조합 근두암종균을 감염시킨다. 재조합 근두암종균은 옥신, 시토키닌을 합성하지 않기 때문에 (∵ 표적 DNA를 T-DNA 영역에 삽입하는 과정에서 옥신, 시토키닌 유전자가 훼손됨) 근두암종을 형성하지 않는다. 따라서 근두암종균을 감염시킨 식물개체 중 근두암종이 형성되지 않은 개체를 선택함으로써 screening을 할 수 있다.

 

 

문제 2. 유전자를 동정하고 유전자 발현을 연구하기 위하여 서던 블롯 분석법, 노던 블롯 분석법, 웨스턴 블롯 분석법을 사용한다. 이 3가지 분석법의 원리와 방법을 각각 설명하시오. 

 

⑴ 서던 블롯 분석법

○ DNA에 대한 핵산 탐침 혼성화를 지칭한다.

○ 원리와 방법은 링크를 참고한다. (ref)  

 

⑵ 노던 블롯 분석법

○ RNA에 대한 핵산 탐침 혼성화를 지칭한다.

○ 서던 블롯 분석법과 비슷하게 진행되지만 다음과 같은 차이가 관찰된다.

○ 차이 1. 시료의 추출 : 서던 블로팅은 DNA 추출법을 이용한다. 이에 반해, 노던 블롯팅은 oligo dT를 이용하는 친화성 크로마토그래피로 추출물에서 mRNA를 효과적으로 분리한다. 

○ 차이 2. 제한효소 사용 유무 : 서던 블로팅은 길이가 긺으로 제한효소를 사용해야 한다. 노던 블로팅은 DNA가 아니라 RNA를 이용하므로 제한효소를 사용할 수 없다. 

○ 차이 3. 모세관 현상 시 용액의 종류 : 서던 블로팅은 단일 가닥 DNA로 변성시키기 위해 염기성 용액을 사용한다. 이로 인해, 음전하를 띠는 DNA 간 척력으로 자연스럽게 DNA가 변성된다. 노던 블로팅에서 염기성 용액을 사용하면 RNA가 분해된다. 대신 노던 블로팅은 RNA를 안정화시키기 위해 염 용액을 사용한다.

○ 차이 4. 탐침의 종류 : 서던 블로팅은 gDNA 탐침을 사용한다. 이에 반해, 노던 블로팅은 cDNA 탐침을 사용한다.

 

⑶ 웨스턴 블롯 분석법

○ 정의 : 단백질에 대한 핵산 탐침 혼성화

○ 핵산 블로팅과 비슷하게 진행되지만 다음과 같은 차이가 관찰된다. 

○ 차이 1. 겔의 종류 : 핵산 블로팅은 아가로스 젤을 이용한다. 이에 반해, 웨스턴 블로팅은 폴리아크릴아마이드 겔, SDS-PAGE 등을 이용한다.

○ 차이 2. 전기영동 전압 조건 : 핵산 블로팅에서 핵산은 전기영동으로 이동을 잘 하므로 저전압을 인가해 주어야 한다. 이에 반해, 웨스턴 블로팅에서 단백질은 전기영동으로 이동을 잘 하지 못하므로 고전압을 인가해 주어야 한다.

○ 차이 3. 블로팅 과정 : 블로팅 과정에서 핵산 블로팅은 모세관 현상을 이용하고, 웨스턴 블로팅은 전기장을 이용한다.

○ 차이 4. 핵산 전처리 : 핵산 블로팅은 연어 정자 DNA 단편을 이용하는 반면, 웨스턴 블로팅은 카제인(casein), 스킴 밀크(skim milk), BSA(bovine serum albumin) 등을 이용한다.

○ 차이 5. 탐침의 종류 : 핵산 블로팅은 DNA 탐침을 이용한다. 웨스턴 블로팅은 항체 탐침을 이용한다.

○ 차이 6. 이미징 방법 : 핵산 블로팅은 EtBr + 자기방사법을 이용한다. 웨스턴 블로팅은 쿠마스블루 염색법을 이용한다.

 

 

문제 3. 대장균 RNA 중합효소는 프로모터를 인식하여 전사를 시작한다. 다음 물음에 답하시오.

 

⑴ 3-1. 대장균 RNA 중합효소의 구성과 각 소단위체(subunit)의 기능에 대하여 기술하시오.

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 1. 대장균 RNA 중합효소의 구성

 

○ 전효소(holoenzyme)은 α2ββ'ωσ라고 할 수 있고, core enzyme은 α2ββ'ω이라고 할 수 있다.

○ β : phosphodiester bond 형성, rNTP와 결합

○ β' : DNA 주형과 결합

○ σ : 프로모터 인식, 합성 개시. 재사용됨

 

⑵ 3-2. σ⁷⁰ 소단위체와 α 소단위체가 인식하는 프로모터의 특성에 대하여 설명하시오. 

 

○ core enzyme : α 소단위체만 관여하는 경우

○ no specific binidng

○ tight non-specific DNA binding

○ K_d ≒ 5 × 10^-12 M 

○ holoenzyme : σ⁷⁰ 소단위체도 관여하는 경우

○ specific promotor binding

○ weak non-specific DNA binding

○ K_d ≒ 10^-7 M

○ finds promotor 10,000 times faster

 

 

문제 4. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)은 특정 DNA 조각을 증폭시키는 매우 유용한 기술이다. 이 연쇄반응에 필요한 4가지 요소(온도순환계와 완충용액은 제외)를 쓰고, 연쇄반응의 원리를 설명하시오.

 

⑴ 4가지 요소

○ 시료 1. DNA 주형 

○ 시료 2. DNA 프라이머

○ 조건 1. GC content > 50% 

○ 조건 2. 5' 말단은 AT로 끝나고 3' 말단은 GC로 끝남 : self-ligation으로 인해 hair pin이 생기는 것을 막기 위함

○ 조건 3. 3' 말단에서 2 ~ 3개의 G, C가 겹치게 함 : A=T 결합은 이중결합이고 G≡C 결합은 3중 결합이기 때문에 G, C가 겹치면 더욱 결합이 잘 됨

○ 시료 3. dNTP

○ NTP는 RNA 중합의 재료임을 유의

○ 시료 4. Taq 중합효소(Taq polymerase)

○ Taq 중합효소는 고열의 온천수에 서식하는 고세균 Thermus aquaticus로부터 얻어짐

○ Taq 중합효소 55℃ 최적의 중합반응, 92 ~ 95 ℃ 열변성

○ Taq 중합효소는 3' 말단까지 중합을 한 뒤에도 추가적으로 A를 첨가 : 주형을 필요로 하지 않으므로 평활말단의 DNA의 재조합에 응용할 수 있음

○ 기타 시료 : MgCl₂, IPP(inorganic pyrophosphatase) 등 

 

⑵ 연쇄반응의 원리

○ 단계 1. DNA 변성(denaturing) : DNA 두 가닥을 분리하기 위해 가열하는 단계. 94 ℃. 30 ~ 60 초

○ 단계 2. 프라이머 부착(annealing) : 혼합물이 식음에 따라 프라이머들이 DNA 주형에 결합. 50 ~ 55 ℃. 1 분

○ 단계 3. DNA 중합(elongation) : 중합효소는 프라이머에서 합성을 개시. 72 ℃. 1000 bp 당 1분 정도의 시간

○ 단계 4. 단계 1 ~ 단계 3 과정을 반복하면 이론적으로 2의 지수적으로 DNA 채취 시료가 복제

○ 단계 5. DNA 연결효소(ligase) 작용(40 ℃) 및 안정화(4 ℃)

○ 단계 6. 몇 사이클 후 대장균 클로닝 증폭으로 전환 : 실제로는 인공 뉴클레오티드의 양이 부족해 훨씬 적은 DNA가 생산

 

입력: 2021.05.26 01:57