【분자생물학】 2016년 제53회 변리사 2차 국가자격시험

2016년 제53회 변리사 2차 국가자격시험

 

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a. 중심학설

b. DNA 테크놀로지 

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문제 1. 유전체 서열이 모두 알려진 모델 식물 벼(rice)를 자연상태와 다른 재조합 T-DNA를 갖는 아그로박테리아(Agrobacterium tumefaciens)로 형질전환하여 10만 개의 T-DNA 삽입 돌연변이체를 얻었다. 이들 각각에는 단지 1개의 T-DNA가 무작위 삽입된 것으로 가정한다. 길이 6 kb인 재조합 T-DNA의 염기서열은 모두 알려져 있으며, 우성(dominant)의 카나마이신 저항성 유전자를 포함한다. 다음 물음에 답하시오.

 

⑴ 1-1. 자연상태의 아그로박테리아는 식물체에 줄기종양(crown gall)을 만들어내지만, 재조합 T-DNA 형질전환체는 줄기종양을 만들지 않는다. 이런 차이가 나타나는 원인을 식물생장과 관련하여 설명하시오.

 

○ T-DNA에는 옥신, 시토키닌이 있어 근두암종을 형성하게 된다. 그러나 표적 DNA를 T-DNA 영역에 삽입하게 되면 위 물질을 합성하지 못하게 되어 줄기종양이 생기지 않게 된다.

 

⑵ 1-2. PCR 기법과 재조합 T-DNA에 존재하는 제한효소 자리(restriction site)를 이용하여 벼 유전체의 어느 부위에 T-DNA가 삽입되었는지를 알아낼 수 있는 방법을 설명하시오.

 

출처 : 이미지 클릭

Figure. 1. 제한효소 자리

 

○ 기본적인 아이디어는 제한효소 절편 지도(restriction enzyme fragment map)를 활용하는 것이다.

 

○ 전제 : 위 그림과 같이 3' 말단 쪽에 점착성 말단이 생기는 제한효소를 사용해야 한다. 또한, T-DNA는 환형 DNA이다.

 

○ 위 그림의 경우 5'-TGCAG-3'으로 시작하는 프라이머를 도입한 뒤 PCR을 수행하면 DNA 절편들을 증폭할 수 있다. 선형 DNA의 경우 두 종류의 DNA 프라이머가 필요하지만, 환형 DNA에서는 한 종류의 DNA 프라이머만 있으면 된다. 이후 DNA ladder와 함께 전기영동을 하면 각 DNA 절편들의 길이를 추정할 수 있다. 서로 다른 제한효소들을 적절히 조합하면 주어진 유전체에서 각 제한효소들의 인식부위를 결정할 수 있다. (길이가 6 kb인 게 주어져 있으므로 더 간단해질 수도 있다.)

 

○ 한편, 제한효소가 T-DNA 내부 또한 인식한다는 전제 하에 위와 같은 방법으로 T-DNA가 삽입된 벼 유전체와 T-DNA가 삽입되지 않은 벼 유전체의 제한효소 인식부위를 비교하면 T-DNA가 벼 유전체의 어느 부위에 삽입됐는지 알 수 있다.

 

⑶ 1-3. 역유전학 방법(reverse genetics)으로 유전자 A에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체, 즉 유전자 A에 대한 이형접합체를 선발하였다. 유전자 A의 knock-out(KO) 변이체를 얻기 위하여 이 식물체를 자가수분하여 1,000개의 볍씨를 얻었다. 이들 볍씨 중 카나마이신 저항성 볍씨와 유전자 A가 KO된 볍씨의 비율을 구하시오.

 

○ 정유전학 방법과 역유전학 방법

○ 정유전학 방법(forward genetics) : 알려진 표현형에 대한 유전자를 찾아내는 전략

○ 역유전학 방법(reverse genetics) : 알려진 유전자에 대한 표현형을 찾아내는 전략

○ 본문은 특정 유전자 서열을 바꿨을 때 표현형이 바뀌는지 아닌지로 이형접합체를 선발했다는 의미이다.

 

○ 정상 A 유전자를 A⁰, A 유전자에 T-DNA가 삽입되어 knock-out 된 것을 A^KO라고 하자. 이형접합체는 A⁰A^KO로 표시할 수 있다. A^KO 보인자라면 우성의 카나마이신 저항성 유전자가 발현하고, A^KO 동형접합이어야 A가 KO된 볍씨라 할 수 있다.

○ 자가수분 : A⁰A^KO × A⁰A^KO = A⁰A⁰ (25%), A⁰A^KO (50%), A^KOA^KO (25%) 

○ 결론 : 볍씨 중 카나마이신 저항성 볍씨 ÷ 유전자 A가 KO된 볍씨 = 75% ÷ 25% = 3

 

 

문제 2. 애기장대의 유전자 P에 관한 다음 물음에 답하시오.

 

⑴ 2-1. 비번역지역(UTR), 인트론, 엑손, 프로모터, 번역시작점과 번역종결점, 전사시작점과 전사종결점을 표시하여 유전자의 개념도를 그리시오.

 

Figure. 2. 유전자의 개념도

 

⑵ 2-2. 유전자 P는 유전체 분석을 통해 염기서열에 대한 특허가 등록되어 있으나 그 기능에 대해서는 알려져 있지 않다. 과학자 A가 연구를 수행하여 P 유전자의 발현이 저온 스트레스에 의해 꽃의 수술에서 유도되고, 이 유전자가 애기장대의 저온 스트레스 저항성을 높이는 것을 알아내 특허 등록하였다. 상기 (1)의 구성요소를 고려하여 과학자 A가 수행한 연구의 실험적 과정을 기술하시오.

 

○ 과정 1. P 유전자의 발현이 저온 스트레스에 의해 꽃의 수술에서 유도된다는 사실

○ 식물체와 관련된 실험에서 대체로 상온은 25 ℃, 저온은 14 ℃를 의미한다. (ref)

○ 식물 조직계에 따른 실험군 분류 : 꽃의 수술, 꽃의 암술, 줄기, 뿌리, 잎

○ 온도에 따른 실험군 분류 : 25 ℃, 14 ℃

○ 전체 실험군 분류 : 총 5 × 2 = 10개의 실험군이 생성됨

○ 이 중 꽃의 수술 / 14 ℃과 꽃의 수술 / 25 ℃의 fold-change를 조사하고 유의수준 0.05 하에서 유의미함을 증명

○ 다른 조직계에서는 25 ℃에 비해 14 ℃에서 유의미하게 유전자 발현이 증가하지 않음을 증명

 

○ 과정 2. P 유전자가 애기장대의 저온 스트레스 저항성을 높인다는 사실

○ 경우 1. P 유전자 knock-out 식물체와 wild-type 식물체 간에 14 ℃ 하에서 식물 생존율을 측정

○ 경우 2. P 유전자의 siRNA를 처리한 식물체와 wild-type 식물체 간에 14 ℃ 하에서 식물 생존율을 측정

○ 경우 1과 경우 2 모두 유의수준 0.05 하에서 유의미함을 증명

 

 

문제 3. apoptosis(세포자살)는 생명체가 선택적으로 세포를 제거하는 방법이다. 다음 물음에 답하시오.

 

⑴ 3-1. apoptosis는 크게 2가지 다른 경로로 진행된다. 이 2가지 경로는 무엇이며, 각 경로는 어떻게 시작되는지 설명하시오.

 

○ 경로 1. 외부 신호에 의한 세포 예정사 기전 : Fas 또는 TNF가 수용체와 결합하면서 시작한다. 그 뒤 caspase 8과 adaptor가 결합하여 DISC가 형성된다. DISC는 caspase 3을 활성화시키고, caspase 3은 세포사멸을 일으킨다.

 

○ 경로 2. 내부 신호에 의한 세포 예정사 기전 : 내부 신호가 미토콘드리아 내막에 있는 Bax, Bak가 oligomer가 되도록 한다. oligomer는 porin을 형성하여 막간공간의 cyt c를 세포질로 유출시킨다. cyt c는 Apaf-1과 결합하여 CARD를 형성한다. 마지막으로 CARD는 세포사멸을 일으킨다.

 

⑵ 3-2. apoptosis 중인 동물세포에서 나타나는 5가지 현상을 열거하고, apoptosis를 분석하기 위한 2가지 대표적인 방법을 기술하시오.

 

○ apoptosis 중인 동물세포에서 나타나는 5가지 현상

○ 세포 내의 DNA가 규칙적으로 단편화됨

○ 카스파제 등 체계적인 신호전달이 일어남 

○ bleb이 형성됨

○ 포스파티딜 세린이 세포 밖으로 노출되는 등 막의 비대칭성이 파괴됨 

○ 식세포작용이 일어남

 

○ apoptosis를 분석하기 위한 2가지 대표적인 방법

○ annexin-V staining : 인지질의 비대칭성이 깨진 세포막의 바깥쪽의 포스파티딜 세린에 대한 staining assay

○ TUNEL assay (terminal transferase dUTP nick-end labeling) : apoptosis로 분해되는 dsDNA를 측정하는 assay

○ γ-H2AX assay : DNA 이중나선 결합의 파괴 여부를 보여주는 assay

○ Calcein-AM assay : live cell이 많으면 신호가 크게 나옴

○ PI(propidium assay) : dead cell이 많으면 신호가 크게 나옴

○ Ki-67 assay : Ki-67은 cell proliferation marker로 쓰임

○ DAPI : DNA 부홈의 AT region에 결합. apoptosis marker로도 사용

○ CD8-PD1 : 높을수록 apoptosis가 많이 일어남을 의미

○ caspase 3/7 : apoptosis marker

○ PARP cleavage : apoptosis marker

○ 8-OHdG (8-hydroxy-2’-deoxyguanosine) : DNA oxidative marker

○ CC3(cleaved caspase 3) staining : apoptosis assay

 

⑶ 3-3. 동물세포에서 apoptosis와 necrosis(세포괴사)의 차이점 3가지를 기술하시오.

○ 차이 1. apoptosis는 ATP를 사용하는데 necrosis는 ATP를 사용하지 않음

○ 차이 2. apoptosis는 서서히 일어나는데 necrosis는 갑작스럽게 일어남

○ 차이 3. apoptosis는 염증반응을 수반하지 않는데 necrosis는 염증반응을 수반함

 

 

문제 4. 진핵세포의 class Ⅱ 프로모터는 mRNA 전사를 조절한다. 다음 물음에 답하시오.

 

⑴ 4-1. class Ⅱ 프로모터 중 TATA box가 없는 유전자 그룹 2가지를 기술하시오.

 

○ 다음 문장에 주목하자. In the majority of TATA-less promoters, GC rich and/or CCAAT elements are among the most common RNA Polymerase II (Pol II) promoter elements (Geier et al. 2003; Hu et al. 2000; Muredda et al. 2003).

○ 답 : CAAT box (-75 box), GC box

 

⑵ 4-2. TATA box가 존재하는 class Ⅱ 프로모터로부터 TATA box를 인위적으로 제거할 경우 유전자에 따라 달리 나타나는 현상 2가지를 기술하고, 각 현상으로부터 추론할 수 있는 TATA box의 기능에 대해 기술하시오.

 

○ 현상 1. 유전자 발현이 전혀 없는 경우 : TATA box는 TBP(TATA-binding protein)와 결합하여 프로모터를 구성. rRNA, mRNA, tRNA 모두 해당

○ 현상 2. 유전자 발현이 적어진 경우 : TATA box는 보편전사인자 중 하나인 TFIID와 결합하여 유전자 전사를 조절

○ TATA-dependent gene도 있음을 유의

 

⑶ 4-3. 특정 class Ⅱ 프로모터의 상위(upstream) 지역에 반복서열을 갖는 부위가 발견되었으며 이 부위가 해당 유전자의 발현을 조절하는 enhancer로 작용할 가능성이 제기되었다. 이를 증명할 실험을 디자인하고 논리적 근거를 기술하시오.

 

○ 반복수에 따른 유전자 발현 추이를 조사

○ 헌팅턴 병의 경우 반복수가 증가하여 질환의 발병이 증가하는 것으로 알려져 있음 (유전자 예상현상)

 

입력: 2021.03.14 23:53