【생물학】 10-2강. 후성유전체 시퀀싱

10-2강. 후성유전체 시퀀싱(epigenomics sequencing)

 

추천글 : 【생물학】 10강. 게놈 프로젝트와 시퀀싱 기술 

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1. 종류 1. gene function 식별 [본문]

2. 종류 2. transcription regulation 식별 [본문]

3. 종류 3. post-translational regulation 식별 [본문]

4. 종류 4. programmable cell function [본문]

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a. 후성유전학 라이브러리

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1. 종류 1. gene function 식별 [목차]

⑴ Perturb-seq

① 1^st. 여러 종류의 gRNA library를 Cas9-expressing cell을 처리

○ CRISPR-Cas9을 사용함으로써, 각 세포에서는 gRNA의 종류에 따라 다양한 변화(perturbation)가 발생

○ 필터링 후 250만 개 이상의 세포가 있어야 함 

○ perturbation 당 평균 100개 이상의 세포가 있어야 함

○ 세포당 10,000개 정도의 UMI가 있어야 함 

② 2^nd. gRNA와 mRNA를 모두 탐지하는 시퀀싱 기술을 사용 (e.g., scRNA-seq, MERFISH)

③ 3^rd. gRNA를 발현하는 세포별로 그룹핑 : 자연스럽게 perturbation 조건별로 세포들이 그룹핑

④ 4^th. gene 기능 식별 

○ 전제 : 비슷한 기능을 하는 gene끼리는 비슷한 expression 패턴을 보일 가능성이 높음

○ 알 수 있는 결과 1. perturbation에 따른 유전자 발현 변화

○ 알 수 있는 결과 2. 유전자 변이에 따른 perturbation 영향 차이

 

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Figure. 1. 검증 실험을 포함한 Perturb-seq의 일반적인 모식도

 

⑵ in vivo Perturb-seq 

① 1^st. 마우스에 Cre를 포함한 AAV(Adeno-associated virus)를 전달하여 마우스가 Cas9을 발현하도록 함

② 2^nd. sgRNA를 담고 있는 lentivirus를 전달

③ 3^rd. CRISPR-Cas9 시스템에 의해 in vivo에서 각 Cas9 발현 세포에서 gRNA에 따라 다양한 변화(perturbation)가 발생

④ 4^th. 약 10일 간 반응을 기다린 뒤 scRNA-seq 및 MERFISH를 수행 

 

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Figure. 2. in vivo Perturb-seq 과정

 

 

2. 종류 2. transcription regulation 식별 [목차]

⑴ BS-seq(bisulfite sequencing)

① bisulfite를 처리하여 methylation 패턴을 결정

② epigenomic profilig을 가능하게 함

⑵ ChIP-seq(chromatin immunoprecipitation sequencing)

① 정의 : 전사인자 등 특정 단백질과 결합한 DNA 부위를 분석할 수 있음

② DNA-associated protein의 결합 자리를 알기 위해 DNA 시퀀싱과 ChIP(chromatin immunoprecipitation)를 결합

③ 1^st. 단백질(예 : 전사인자)과 DNA를 고정하기 위해 cross-linking agent (예 : formaldehyde)를 처리

④ 2^nd. 세포를 용해시켜 DNA/protein complex만 남도록 함

⑤ 3^rd. sonication을 통해 DNA를 작은 조각들로 파괴 : 200-350 bp. cross-link 된 DNA는 파괴되지 않음

⑥ 4^rd. magnetic bead가 부착된 항체를 첨가 : 자기장을 가하면 특정 단백질 및 그와 연결된 DNA를 분리할 수 있음

⑦ 5^th. reverse cross-linking : 침전물에 열을 가하여 DNA를 단백질로부터 분리

⑧ 6^th. 염기서열을 알기 위해 sequencing을 진행 : PCR amplification, fragment size selection, adaptor addition이 진행됨

⑨ 7^th. 최종적으로 게놈 레퍼런스와 비교하여 전사인자 등의 binding site를 알 수 있음

 

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Figure. 3. ChIP-seq 과정

 

⑩ 응용 1. ChIP-chip : ChIP-chip의 HTS 버전이 ChIP-seq

⑪ 응용 2. ChIP-PET 

⑫ 응용 3. ChIA-PET : ChIP-seq은 전사인자 등 특정 단백질의 결합 위치만 알 뿐이고 ChIA-PET은 결합된 DNA 사이의 상호작용 조사 

⑬ 응용 4. RIP-seq

⑭ 응용 5. CLIP-seq 

⑮ 응용 6. meDIP-seq : DNA methylation 또는 hydroxymethylation 

⑯ 응용 7. ChIP-exo : lambda exonuclease digestion 사용. 실험 기법이 어려움 

⑰ 응용 8. CUT&RUN (cleavage under targets and release using nuclease)

○ MNase (micrococcal nuclease) 사용 

⑱ 응용 9. CUT&Tag (cleavage under targets and tagmentation)

○ 개요

○ Tn5 transposase는 DNA의 열린 구간을 자르는 효소로 single nucleosome, dimer, trimer, ⋯ 등 다양한 절편을 만듦

○ Tn5 transposase는 sticky end를 만들어서 DNA 삽입을 촉매함

○ adaptor를 직접 병합할 수 있어서 바로 시퀀싱을 진행할 수 있음

○ 과정

○ 단계 1. 핵들에 magnetic bead를 붙인 뒤 자기장을 이용해 세포들을 획득 

○ 단계 2. 1차 항체 첨가 : 항체의 퀄리티가 데이터 퀄리티에 큰 영향을 줌 

○ 단계 3. 2차 항체 첨가 

○ 단계 4. conjugated Tn5-transposase가 복합체에 결합하고 열린 DNA 영역 주변을 절단 

○ 단계 5. PCR amplification, fragment size selection, 시퀀싱

○ 종류

○ MuLTI-Tag : direct barcode conjugation을 통해 multiplexing에서의 crossover를 최소화

○ multi-CUT&Tag : barcoded Tn5/pA-antibody complex를 이용. mark들의 colocalization 등을 확인할 수 있음 

○ spatial-CUT&Tag : 조직 상에 공간적으로 히스톤 수식 및 염색체 상태를 보여줌

 

	CUT&Tag	CUT&RUN	ChIP-Seq
native condition?	Yes	Yes	No
sample input	nuclei	cells or nuclei	sheared chromatin
cell number	100,000 cells	500,000 cells	1-10 million cells
chromatin fragmentation	Tn5-based tagmentation	MNase digestion	sonication
ideal target	histone PTM	histone PTM, chromatin-associated protein, remodeler	histone PTM, chromatin-associated protein
secondary antibody	Yes	No	No
library preparation	No (direct-to-PCR)	Yes	Yes
integrated library	possible; uses tagmentation	impossible	impossible
sequencing depth	5-8 million reads	3-5 million reads	20-50 million reads
workflow length	< 2 days	< 3 days	~ 1 week
automation compatibility	high	high	low
signal-to-noise	high	high	low

Table. 1. CUT&Tag vs. CUT&RUN vs. ChIP-Seq (ref, ref, ref, ref)

 

⑶ Hi-C(high throughput chromatin conformation capture sequencing)

① 정의 : 자연적으로 염색체 상에서 가깝게 인접한 염기서열을 조사

② DNA 간 거리를 조사하여 핵 내 염색체의 3차원 접힘 구조를 볼 수 있음

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Figure. 4. Hi-C 과정

 

③ 응용 1. ChIA-PET 

○ 차이 : Hi-C는 자연적으로 형성된 모든 DNA-DNA 상호작용. ChIA-PET은 특정 단백질이 매개하는 DNA-DNA 상호작용을 연구

⑷ DNA ticker tape (prime editing)

① 1^st. 맨 처음에는 첫 번째 사이트만 활성화 돼 있음

② 2^nd. 첫 번째 이벤트가 일어나면 두 번째 사이트가 활성화됨

③ 3^rd. 이런 식으로 시계열적 분자적 이벤트를 기록할 수 있음

⑸ ENGRAM(enhancer-driven genomic recording of transcriptional activity in multiplex)

① synthetic enhancer와 연결된 perRNA를 이용

② 신호전달의 순서와 강도를 기록할 수 있음

③ 레퍼런스 : Chen et al., bioRxiv (2021) 

⑹ ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin with sequencing)

① 개요

○ 정의 : 진정염색질 부분을 표시해 주는 시퀀싱 기법

○ pseudo-expression : 진정염색질은 gene expression이 있는 영역으로 추정할 수 있음

○ Tn5 transposase는 DNA의 열린 구간을 자르는 효소로 single nucleosome, dimer, trimer, ⋯ 등 다양한 절편을 만듦

○ Tn5 transposase는 sticky end를 만들어서 DNA 삽입을 촉매함

○ adaptor를 직접 병합할 수 있어서 바로 시퀀싱을 진행할 수 있음

○ ATAC-seq에서 관찰되는 10 bp 정도의 periodicity가 DNA 1 회전당 10 bp가 필요한 것과 관련 : minor groove distance

 

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Figure. 5. ATAC-seq fragment size distribution

 

② 종류 1. bulk ATAC-seq

○ 단계 1. 핵 분리(nuclei isolation)

○ 단계 2. Tn5 transposase 처리 : 이는 염색체에서 응축이 덜한 open region을 잘라 DNA sequence tag를 삽입

○ 단계 3. amplification & sequencing

○ 단계 4. 데이터 분석 

③ 종류 2. scATAC-seq

○ cell type에 특이적인 CRE를 정의하여 regulatory TF를 규명하고 질환 및 형질과 관련된 cell type을 식별

○ GWAS variant를 해석할 때 scATAC-seq이 활용됨 

○ scRNA-seq과 scATAC-seq의 비교 

○ scRNA-seq : x_ij ∈ ℤ_≥0 

○ scATAC-seq : x_ij ∈ {0, 1}, j ≫ i

④ 종류 3. spatial ATAC-seq

⑤ 종류 4. FAIRE-seq 

⑥ 종류 5. DNaseI-seq : 염색질과 상호작용하는 전사인자의 종류를 알 수 있음 

 

출처: Sung et al, 2014

Figure. 6. DNaseI-seq 결과 예시

 

⑦ 종류 6. MNase-seq

 

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Figure. 7. ATAC-seq과 다양한 시퀀싱 기법 비교

 

⑺ NOMe-seq (nucleosome occupancy and methylome sequencing)

① TF가 결합하는 뉴클레오솜 고갈 영역(NDR)을 정의

② 염색질과 상호작용하는 전사인자의 종류를 알 수 있음 

⑻ MBD-seq

⑼ Ribo-seq

① 리보솜에 의해 보호된 RNA를 시퀀싱. 활발한 번역을 나타냄 

⑽ Bru-seq & BruChase-seq 

① 전사된지 얼마 안 된 nascent RNA를 Bru(bromouridine)를 표지한 뒤 시퀀싱 

② RNA 합성, RNA 안정성, 스플라이싱 등을 연구할 때 사용 

 

 

3. 종류 3. post-translational regulation 식별 [목차]

⑴ scRibo-seq

① 각 single codon 별 ribosomal occupancy를 측정 

② 1^st. FACS 및 lysis 

③ 2^nd. nuclease footprinting : MNase nuclease → inactivation → release of footprints

④ 3^rd. small-RNA library 생성 : end repair → 3' ligation → 5' ligation → cDNA synthesis → indexing PCR 

⑵ STAMP-RBP

① RBP(RNA binding protein)을 찾기 위해 scRNA-seq을 이용

② 1^st. RBP에 APOBEC를 붙임

③ 2^nd. APOBEC와 mRNA가 붙은 지점에서 C-U editing이 되도록 함 : 즉, C 염기를 U 염기로 치환

④ 3^rd. RNA-seq

⑤ 4^th. SAILOR를 이용하여 C-U editing이 일어난 지점을 식별

⑥ long read sequencing을 이용하여 isoform-specific binding profile을 식별할 수도 있음 

 

 

4. 종류 4. programmable cell function [목차]

⑴ RADARS 

① 1^st. target transcript가 있을 때 dsRNA를 형성하여 ADAR로 하여금 A-C editing이 일어나게 함

② 2^nd. 위 editing으로 인해 GFP, caspase 등 cellular behavior가 일어나도록 함

⑵ LADL(light-activated dynamic looping) 

① photo-activatable gene expression의 예시 중 하나

 

입력: 2022.01.10 00:03

수정: 2023.01.28 23:12